蛹虫草固体培养产子实体条件的优化及其虫草素含量测定

刁朝强，文庭池，廖 勇，康冀川，周建云，谢红艳

(1.贵州省烟草公司贵阳市公司，贵州 贵阳 550025；2.山东省农业科学院农业资源与环境研究所，农业部废弃物基质化利用重点实验室，山东省农业面源污染防控重点实验室，山东 济南 250100；3.贵州大学西南药用生物资源教育部工程研究中心 贵州 贵阳 550025)

蛹虫草(Cordycepsmilitaris(L.) Fr.)是麦角菌科的药用虫生真菌，是我国名贵的中药和新资源食品[1]，其所含药用成分和多种药效可与冬虫夏草(Cordycepssinensis(Berk.) Sacc.)相媲美。特别是其活性成分虫草酸和虫草素含量明显高于冬虫夏草[2]，使其得到广泛关注。虫草素即3’-脱氧腺苷是蛹虫草产生的一种重要的次生代谢产物，据文献报道其对枯草杆菌(Bacillussubtilis(Ehr) Cohn)、鸟型结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosisvar.aviumLehm.et Neum)、鼠艾氏腹水疣、人鼻咽癌KB细胞、人表皮样疣及Hela细胞等皆有明显拮抗或抑制作用[2]。经国内有关单位多次对蛹虫草进行的药理药化及临床实验证明[3]，其具有重要的滋补价值，对慢性支气管炎、肝炎、高血压、心脏病、肾炎、肾衰、癌症以及消除疲劳、紧张等有显著治疗和预防作用。

张显科等[4]通过实验得出，大米栽培的蛹虫草和野生冬虫夏草含的重要无机元素，尤其是人体必须的无机元素，两者含量很接近。蛹虫草中各种维生素的含量比冬虫夏草高，有的高出几倍。两者均含有18种氨基酸，蛹虫草中每种氨基酸含量几乎均高于天然冬虫夏草，氨基酸总含量也高出冬虫夏草几倍。蛹虫草中虫草酸、虫草素、虫草多糖和超氧化物歧化酶(SOD)的含量接近或高出冬虫夏草的含量。李楠[5]、彭国平[6]、江晓路[7]也有相似的结论，他们均认为蛹虫草与冬虫夏草成分相近。

冬虫夏草具有很高的药用价值，但由于生长环境和寄生条件特殊而严格，加上近年来采挖过度，天然资源紧张，价格昂贵。因而许多学者致力于蛹虫草的人工培养，本文目的在于对蛹虫草固体培养条件进行探索及优化，并以工业液体发酵菌丝体作对比，对在最优条件下培养出的蛹虫草子实体及采后培养基中虫草素的含量进行检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种 蛹虫草(Cordycepsmilitaris(L.) Fr.)供试菌株4株，编号A、B、C、D，保藏在贵州大学西南药用生物资源教育部工程研究中心。

1.1.2培养基 PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，水1000 mL。摇瓶液体母种培养基：蛋白胨2%，蔗糖 2%，MgSO4·7 H2O 0.05%，KH2PO40.1%，水1000 mL。

米饭培养基营养液：Ⅰ葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO42 g，柠檬酸铵1 g，水1000 mL。Ⅱ 蛋白胨12.5 g，甘油5 g，酵母浸膏5 g，20%马铃薯提取液1000 mL。米饭培养基：大米25 g，麦麸1.3 g，玉米粉0.4 g，豆粉0.4 g，蚕蛹粉0.4 g，装入350 mL的透明玻璃罐头瓶中，分别加入上述营养素液，用耐高温白色聚丙烯膜封口。

1.2 仪器与试剂

仪器：超净工作台SA-1480-Ⅱ，多段编程光照培养箱GXZ型，电热鼓风干燥箱101-2AB，美国LABALLIANCE超声波清洗器，美国Scientific systems公司高效液相色谱仪；试剂：甲醇为色谱纯，虫草素标准品购自美国Sigma公司，其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1料水比筛选 该试验设计11个料水比(基质/水=w/v)，分别为：1∶1.0，1∶1.2，1∶1.4，1∶1.6，1∶1.8，1∶2.0，1∶2.2，1∶2.5，1∶3.0，1∶3.5，1∶4.0。将上述配比培养基装入350 mL的罐头瓶中，121℃高压灭菌25 min，待用。

1.3.2不同菌株、培养基及不同的接种方式比较 将蛹虫草4个不同的菌株A，B，C，D活化后，分别制作为孢子悬液(1)、液体种(2)和斜面种(3)，分别将3种母种接种到Ⅰ，Ⅱ米饭培养基上(表1)。

表1 不同菌株、接种方式、培养基的组合Tab.1 Combination of strains， inoculation method and culture medium

注：A， B， C， D代表不同菌株；Ⅰ、Ⅱ代表不同培养基；1、2、3代表不同的接种方式。

1.3.2.1 菌丝培养 接种后移入培养室，温度控制在23～25℃，空气相对湿度为65～70%，黑暗培养，15 d左右菌丝封底，此时室内增加散射光，5～7 d后培养料表面或四周有桔黄色色素形成，即进入子实体管理时期。

1.3.2.2 子实体管理 菌丝转色完成后，为刺激子实体原基形成，增加光照和温差刺激，每天光照不少于10 h， 温度每天18℃，10 h/24℃，14 h交替，相对湿度提高至80%左右，每天通风30 min以补充新鲜空气，蛹虫草子座长出后，增加光照强度，温度保持22℃左右，空气湿度85%左右，每天通风换气30 min。

1.3.3虫草素含量测定

1.3.3.1 色谱分析条件 色谱柱采用Kromasil C18 (4.6 mm×250 mm， 5 μm)反向硅胶柱，流动相：10 mM KH2PO4溶于甲醇/双蒸水(15∶85)，HPLC测定时流动相流速设定为1 mL/min；检测波长为254 nm，柱温30℃，进样量为20 μL[1]。

1.3.3.2 虫草素标准曲线的制备 精密称取虫草素标准品5 mg，用双蒸水定容至50 mL，则该溶液浓度为100 μg/mL，再依次稀释，得到浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的虫草素标准品溶液，然后采用HPLC测定标准品溶液，流动相流速为1 mL/min，检测波长为254 nm，柱温30℃的色谱条件下，进样20 μL后测定峰面积，以峰面积-浓度做图，得回归方程 C=3.411 92×10-5A-1.284 60， R2=0.999 6。

1.3.3.3 子实体与采后培养基及工业液体发酵蛹虫草菌丝中虫草素含量的测定 将成熟的蛹虫草子实体、采收后的培养基及工业液体发酵菌丝体50℃烘干，用食品粉碎机粉碎，精密称取粉末各0.2 g，置于具塞试管中，加入双蒸水10 ml，超声处理30 min，后在5000 g下离心15 min，最后经0.45 μm滤膜过滤除去固体杂质后用高效液相色谱法检测其中虫草素的含量。HPLC测定时流动相流速设定为1 mL/min，检测波长为254 nm，柱温30℃，进样量为20 μL。所有结果均为三个平行样数值的平均值。

2 结果与分析

2.1 料水比筛选

按各料水比将大米和水装入罐头瓶，高压灭菌后，根据米的软硬度和透气性，比较筛选出1∶1.6效果最好，且子实体培养实验证明，1∶1.6料水比的米饭培养基内部的水分足够蛹虫草子实体形成所需，培养过程不必再补充水分。

2.2 不同菌株、培养基及不同的接种方式比较

不同菌株子实体产量如表2，菌株A每瓶子实体产量最高，菌株B次之，菌株 C和菌株D只产生1～2根或无。菌株A培养成功的成熟蛹虫草子实体如图1所示。

孢子悬液方式接种的实验处理菌丝封底时间为14 d，摇瓶液体母种接种的菌丝封底时间为18 d，而固体斜面菌种接种的封底时间为24 d，比孢子悬液方式接种的处理晚10 d。

与II培养基上培养的蛹虫草相比，I培养基上形成的原基多，子实体高且粗壮。

综合菌株、接种方式、培养基三个因素，筛选出进行蛹虫草子实体固体培养出草率和生物转化率较高，周期短的组合，即菌株A，Ⅰ培养基，孢子悬液接种(即A1Ⅰ组合，其干重产量达到2.72 说g/瓶)。

2.3 虫草素含量测定

在最优化的培养条件下培养，得到的蛹虫草子实体、采后培养基与从企业获得的工业液体发酵蛹虫草菌丝体一并烘干、粉碎后，用高效液相色谱法测得蛹虫草子实体的虫草素含量为10.22 mg/g，采后培养基的虫草素含量为2.04 mg/g，工业液体发酵菌丝的虫草素含量为7.06 mg/g。子实体的虫草素含量是工业液体发酵菌丝中虫草素含量的1.45倍，是采后培养基中虫草素含量的5倍，与温鲁等[8]发表的人工栽培采后培养基的虫草素含量比子实体还要高的结果相反。

表2 不同菌株子实体产量比较Tab.2 Fruiting body yield of different strains

图1 蛹虫草菌株A成熟的子实体Fig.1 Mature fruiting bodies of strain A of Cordyceps militaris

3 讨 论

蛹虫草不同菌株在人工米饭培养基上产生子实体的能力差别很大，菌株A是菌株B的1.75倍(达到2.49 g/瓶)，菌株A的产量和文庭池[9]报道的接近，而菌株 C和菌株D几乎不产子实体。因此规模生产前必须要做产子实体能力的菌株筛选实验。

孢子悬液中的孢子浓度可达到107/mL，所以孢子悬液接种发菌快，生长周期短，适于生产上应用。

蛹虫草子实体中虫草素含量比采后培养基和工业液体发酵菌丝体中虫草素含量都高，但是子实体产量较少，成本较高。因此，在野生冬虫夏草、蛹虫草资源不断减少的情况下，为更好更有效地开发利用虫草资源，可以利用残余的蛹虫草大米培养基提取虫草素及其他活性物质[10，11]。

固体培养出的蛹虫草子实体产量高，但由于所用的罐头瓶狭细，成熟子实体弯曲，外观性状不够好，固体培养的容器需进一步改善。

相同条件下，蛹虫草子实体产量具不稳定性，可能与蛹虫草菌种退化及遗传性状相关，具体原因需进一步深入研究。菌种退化是蛹虫草子实体产业化中较为严重的问题，表现为菌种使用一段时间之后毫无征兆的不长子实体、子实体产量或有效成分含量严重下降，且菌种退化往往是不可逆的，因此会给蛹虫草的生产带来很大的损失[1，12]。目前主要是通过新菌株分离、减少传代次数、菌株复壮和采用适当的菌种保藏方法来减少菌种退化问题[13，14]。

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[6] 彭国平，李红阳，袁永泰.冬虫夏草与人工蛹虫草的成分比较[J]. 南京中医药大学学报，1996，12(5)：26-28.

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