贵州野生刺梨及无籽刺梨不同地理种群间亲缘关系的ISSR分析

陈兴银，彭昌琴，陆赠玉，杨 鹏，关 萍

(贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

刺梨(RoseroxburghiiTratt)，又名送春归、文先果，蔷薇科蔷薇属多年生落叶灌木[1]。原产于云贵高原。主要分布贵州、四川、重庆等地[2]。前人研究报道，刺梨的抗氧化、防癌、抗辐射、消炎等药理作用具有极高的医疗价值。刺梨中含有丰富Vc、多种人体必需氨基酸、黄酮、多糖等物质，具有进一步加工成品的价值，尤其因果实富含Vc而备受国内外关注，同时还具有观赏价值[3-5]。ISSR是Zietkiewicz在1994年所建立的一种分子标记技术[6]。ISSR同时具备RAPD、SSR技术的优点，且具有操作简单、多态性和重复性好等优点。目前ISSR已被广泛应用于植物遗传多样性及植物系统演化、分类等研究[7]。鄢秀芹等对刺梨转录组SSR信息分析[8]。文晓鹏等利用RAPD、AFLP分子标记技术对不同自然分布区刺梨的遗传多样性进行研究，结果表明来自贵州的刺梨遗传多样性最为丰富[9，10]。基于贵州地区刺梨遗传多样性丰富进一步利用ISSR分子标记技术对贵州不同地区野生刺梨及近缘种无籽刺梨亲缘关系近分析。为进一步对刺梨亲缘关系的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

用于ISSR分子标记的14份样品，13份都来自于贵州不同地区，及一份来自于重庆的(表1)。各样品均采集新鲜叶片作为材料，采集后立即用硅胶干燥、保存备用。其表1中样品所对应的序号也是个样品的代号。

表1 研究所用材料名称、来源Tab.1 List of materials used in the study

1.2 试验方法

1.2.1基因组总DNA的提取 取新鲜叶片放于冰盒中，带回-20℃保存备用，植物DNA采用天根公司植物DNA提取试剂盒提取。DNA提取后，1%琼脂糖凝胶和紫外分光光度计检测DNA的质量和浓度，DNA浓度稀释至20 ng/μL，保存备用。

1.2.2引物的合成与筛选 ISSR引物的合成根据加拿大哥伦比亚大学(University of BritisHColumbia，UBC)公布的引物序列(http： / /www.biotech.ubc.ca /services / naps / primers.html)，由昆明硕擎有限公司合成，共50条，从中筛选出扩增产物条带清晰、多态性较好的13条引物用于刺梨与无籽刺梨资源遗传多样性扩增分析。

1.2.3ISSR反应体系及程序 ISSR反应体系为：25 μL反应体系，1 μLDNA模板，1 μL引物，12.5 μLMix，Mix和分子量标准为DL2000的Maker购于昆明硕擎有限公司，其余用ddH2O补齐。扩增程序参照杨帆等(2011)[11]：94℃预变性4 min，94℃变性15 s，58℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃变性15 s，57℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃变性15 s，56℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃变性15 s，55℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃变性15 s，54℃退火35 s，72℃延伸90 s，然后进入下列循环：94℃变性15 s，53℃退火35 s，72℃延伸90 s，共计35个循环，结束后72℃延伸10 min。PCR产物4℃保存。取5 μL在2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳1 h左右，电泳后用凝胶成像系统观察并拍照保存。

1.2.4数据处理 ISSR-PCR扩增产物按条带的有无分别统计条带。有条带记为1，无条带记为0，把得到的0，1分布矩阵从Excel 2003中导入软件NTsys 2.10e中，用SM法计算遗传相似系数，用UPGMA法进行聚类分析，构建树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 ISSR扩增结果

本实验用50条引物对14份材料基因组DNA进行预扩增筛选引物，ISSR扩增结果见表2。13条引物对14份样品进行扩增，共扩增出162条DNA条带，其中150条为多态性条带。扩增出来引物的条带数在4～22之间，平均为12.5条，多态百分率为92.54%，有10条引物扩增的多态性百分率为100%。其中UBC881扩增出来的条带最多(22条)，图1是引物UBC881 ISSR扩增出来的结果。

表2 ISSR引物序列及扩增多态性百分比Tab.2 ISSR primer sequences and I percentage of amplified polymorphism

图1 UBC881引物的电泳结果 M.DL2000 maker

2.2 样品遗传相似系数的ISSR分析

13对引物组合扩增得到162条带，用NTsys2.10e软件计算各个样品间的遗传相似性系数，表3。由表3可知，来自贵州不同地区的14个野生样品，其相互间的相似系数为0.50～0.85。相似系数最大样品组合有两个，分别是来自安顺关岭县与六盘水的刺梨、贵阳息烽与六盘水的刺梨，相似系数均为0.85。相似系数最小样品组合为来自黔西南兴仁的刺梨与贵阳植物园无籽刺梨，相似系数为0.50。相似系数在0.8及以上的组合有8个，分别为来自贵阳燕楼乡与安顺关岭县、毕节七星关区与贵阳息烽的刺梨，相似系数均为0.83。来自毕节七星关区分别与安顺关岭县、六盘水的刺梨组合，相似系数均为0.82。来自安顺关岭县分别与贵阳花溪、贵阳息烽的刺梨组合，相似系数均为0.80。刺梨与无籽刺梨之间相似系数为0.50～0.67。来自贵阳植物园无籽刺梨分别与六盘水、黔西南兴仁的刺梨组合，相似系数分别为0.67、0.50。无籽刺梨互相间的相似系数为0.56～0.78。来自贵阳植物园与黔西南兴仁的野生无籽刺梨、来自安顺光枝无籽刺梨组合相似系数分别为0.56、0.67。来自安顺光枝无籽刺梨与黔西南兴仁的野生无籽刺梨相似系数为0.78。刺梨间相互的相似系数为0.55～0.85。

2.3 样品UPGMA聚类结果分析

由图2可看出，来自铜仁梵净山、贵阳燕楼乡、安顺关岭县、六盘水、毕节七星关区、贵阳息烽的刺梨聚为一支，且来自安顺关岭县刺梨与六盘水刺梨相距最近，亲缘关系最近。来自重庆开县的刺梨单独聚为一支。来自遵义桐梓、贵阳花溪、遵义道真县的刺梨聚为一支，来自贵阳花溪刺梨与遵义道真县的刺梨亲缘关系较近。安顺，光枝无籽刺梨与黔西南兴仁野生无籽刺梨聚为一支，来自黔西南兴仁的刺梨与贵阳植物园无籽刺梨单独聚为一支。

表3 11份野生刺梨和无籽刺梨资源的遗传相似系数Tab.3 Genetic similarity coefficients of R. roxburghii and R. sterilis material

图2 11份刺梨和3份无籽刺梨植物材料的UPGMA聚类树状图Fig.2 UPGMA dendrogram of 11 R. roxburghii and 3 R. sterilis

3 讨 论

在亲缘关系上，相似系数越大，亲缘关系也越近。ISSR分析结果显示，同属遵义市桐梓县和道真县的刺梨，遵义道真县与贵阳花溪亲缘关系比与遵义桐梓的近。同属花溪区的刺梨，贵阳花溪燕楼乡与贵阳息烽县的亲缘关系比与贵阳花溪大。贵州关岭县和贵州六盘水相似系数最大(0.85)，亲缘关系最近。说明刺梨间的亲缘关系与地理分布没有相关性。此结果与文晓鹏对30份不同地方野生刺梨多样性分析的相一致。2009年，安明态等发现贵州蔷薇属的一个新变种，发布新种为光枝无籽刺梨[12]。表2中不同地方的野生刺梨的遗传相无籽刺梨间相似系数为0.56～0.78，组合为黔西南兴仁野生无籽刺梨和安顺光枝无籽刺梨的相似系数最大为0.78，其数值处于刺梨相互间遗传系数0.55～0.85间，且大于刺梨与无籽刺梨相互间的最大相似系数0.67。据此可认为来自黔西南野生兴仁无籽刺梨和安顺光枝无籽刺梨是同一个种。其结果与李旦等利用AFLP分子标记和DNA条形码对无籽刺梨鉴定中得到兴仁无籽刺梨与安顺光枝无籽刺梨为同一种的结果相一致[13]。

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