尿多酸肽注射液中大孔树脂有害残留物的检查方法研究

王 刚

（泰凌生物制药江苏有限公司，江苏泰州225300）

0 引言

尿多酸肽注射液常与化疗联合应用，可用于晚期乳腺癌、非小细胞肺癌的辅助治疗，近年还用于骨髓增生异常综合征的治疗。在尿多酸肽注射液合成过程中，使用了大孔树脂吸附工艺，树脂中可能存在的有害残留物为苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯等。参照《中国药典》（2015年版）一部收录的“三七总皂苷”[1]树脂残留检测相关方法及限度，苯的限度定为0.000 2%，甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的限度定为0.002%。由于尿多酸肽注射液在生产过程中使用了95%乙醇作为洗脱剂，在极性柱中苯与乙醇难以分离，故本文建立了两种分析方法进行测试，采用毛细管气相色谱法，以顶空进样方式分别用方法1测定甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的残留量，用方法2测定苯的残留量，均具有较高的准确度、精密度。

1 仪器、试药

1.1 仪器

AUW120D岛津十万分之一天平；Agilent 7890A气相色谱仪（FID检测器）；Agilent OpenLAB色谱工作站；Agilent 7694E顶空进样器；Agilent VF-WAXms（30 m×250μm×0.25μm）毛细管色谱柱；Agilent DB-624（30 m×0.32 m×1.8μm）毛细管色谱柱。

1.2 试药

尿多酸肽注射液，由泰凌生物制药江苏有限公司提供；乙醇（GENERAL-REAGENT）、苯、N，N-二甲基甲酰胺（以下简称为DMF），国药集团化学试剂有限公司；甲苯，上海凌峰化学试剂有限公司；对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯（adamas-beta）均为不低于99%的试剂；二乙烯苯（阿拉丁）为80%的试剂。乙醇（GENERAL-REAGENT）、苯、DMF、甲苯，均为分析纯。

2 溶液的配制

2.1 方法1对照品溶液配制

2.1.1 对照品贮备液配制

精密称取甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯各20 mg、二乙烯苯25 mg，置同一个10 mL量瓶中，加DMF溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品母液1；再精密量取1.0 mL置100 mL量瓶中，加DMF稀释并定容至刻度，摇匀，作为对照品贮备液1。

2.1.2 对照品溶液配制

精密量取10.0 mL对照品贮备液1置100 mL量瓶中，加25%DMF稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液1。

2.2 方法2对照品溶液配制

2.2.1 对照品贮备液配制

精密称取苯20 mg置10 mL量瓶中，加DMF溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1.0 mL置100 mL量瓶中，加DMF定容至刻度，摇匀，作为对照品母液2；再精密量取10 mL置100 mL量瓶中，加25%DMF定容至刻度，摇匀，作为对照品贮备液2。

2.2.2 对照品溶液配制

精密量取10.0 mL对照品贮备液2置100 mL容量瓶中，加25%DMF稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液2。

2.3 定位溶液

精密称取苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、乙醇各20 mg、二乙烯苯25 mg，分别置10 mL量瓶中，加DMF溶解并定容至刻度，摇匀；再分别精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加25%DMF定容至刻度，摇匀，作为相应的定位溶液。

2.4 混合定位溶液

精密称取尿多酸肽注射液（160402批）供试品1g，置10 mL量瓶中，分别精密量取1.0 mL的对照品贮备液1、对照品贮备液2，加25%DMF溶解并定容，摇匀，作为混合定位溶液。

2.5 供试品溶液配制

精密称取尿多酸肽注射液（160402批）供试品约1 g，置10 mL量瓶中，加25%DMF溶解并定容，摇匀，作为供试品溶液。

3 甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯研究

3.1 测定法

取对照品溶液1顶空进样，记录色谱图，甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯各峰的分离度均应符合规定，理论板数不低于5 000；再取供试品溶液顶空进样，记录色谱图，按面积外标法计算甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的含量，含甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯均不得超过0.002%。

3.2 分析方法验证

3.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent VF-WAXms（30 m×250μm×0.25 μm）；载气：高纯氮气；分流比：10∶1；恒压模式：15×6 894.757 Pa；气化室温度：210 ℃；检测器温度：230℃；柱温：初始60℃，维持16 min，然后以20℃/min升至200℃，维持2 min；顶空瓶温度：90℃；定量杯温度：95℃；传输线温度：100℃；顶空平衡时间：30 min，进样时间：1.0 min；进样体积：1 mL。

3.2.2 专属性

分别精密量取25%DMF、定位溶液、供试品溶液、混合定位溶液各5 mL，顶空进样，记录色谱图，试验结果如表1所示。

3.2.3 进样精密度

取对照品溶液1连续进样6针，顶空进样，记录色谱图，计算甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯峰面积的相对标准偏差RSD，试验结果如表2所示。结果表明：甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯峰面积的相对标准偏差RSD均小于5.0%，该方法的进样精密度良好。

3.2.4 检测限与定量限

分别取甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯定位溶液，并依次稀释至一定浓度，分别以信噪比S∶N=10∶1及3∶1时的浓度作为定量限及检测限，试验结果如表3所示。

3.2.5 线性与范围

根据定量限结果，配制各成分定量限浓度的混合液；再精密量取0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL的对照品母液1置100 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，作为浓度梯度溶液；精密量取各浓度梯度溶液1.0 mL，分别置10 mL量瓶中，用25%DMF稀释至刻度，摇匀，作为线性试验溶液；顶空进样，记录色谱图，以浓度C（μg/mL）为横坐标，峰面积AS为纵坐标，进行线性回归，试验结果如表4所示。

结果表明：在一定浓度范围内，甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的峰面积与浓度间均呈现良好的线性关系。

3.2.6 重复性试验

精密称取本品（160402批）约1.0 g，置于10 mL量瓶中，精密加入1.0 mL对照品贮备液1，用25%DMF稀释定容，摇匀，作为试验溶液，平行制备6份。分别精密量取对照品溶液1及供试品溶液5 mL，顶空进样，按外标法计算各成分含量，试验结果如表5所示。结果表明：该方法的重复性良好。

表1 专属性试验结果

表2 精密度试验结果

表3 检测限与定量限试验结果

表4 线性试验结果

表5 重复性试验结果

3.2.7 回收率试验

精密称取本品（160402批）9份，每份约1.0 g，分别置于10 mL量瓶中，精密加入1.0 mL 80%、100%、120%三个浓度级别的对照品贮备液1，用25%DMF稀释定容，摇匀，作为80%、100%、120%试验溶液，每个浓度级别平行制备3份。精密量取对照品溶液及各浓度级别试验溶液，顶空进样，记录色谱图，按面积外标法计算并扣除本底，回收率试验结果如表6所示。结果表明：甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的回收率结果良好，该方法的准确度高。

表6 回收率试验结果

3.3 供试品测定

依法测定1504011、1504021、1504031、1504012、1504022、1504032、160401、160402、160403、160501共10个批次的尿多酸肽注射液供试品，均未检测出甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯。

4 苯的研究

4.1 测定法

取对照品溶液2顶空进样，记录色谱图，苯的理论板数不低于5 000；再取供试品溶液顶空进样，记录色谱图，按面积外标法计算苯的含量，含苯不得超过0.000 2%。

4.2 分析方法验证

4.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent DB-624（30 m×0.32 mm×1.8 μm）；载气：高纯氮气；分流比：10∶1；恒压模式：15×6 894.757 Pa；柱温：初始60 ℃，维持16 min，以20℃/min升至200℃，维持2 min；气化室温度：210℃；检测器温度：230℃；顶空瓶温度：90℃；定量杯温度：95℃；传输线温度：100℃；顶空平衡时间：30 min；进样时间：1.0 min；进样体积：1 mL。

4.2.2 专属性

精密量取25%DMF、定位溶液、混合定位溶液、供试品溶液各5 mL，分别顶空进样，记录色谱图，试验结果如表7所示。结果表明：甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、乙醇对测定无干扰；苯的理论板数大于5 000。

4.2.3 进样精密度

取对照品溶液2连续进样6针，顶空进样，记录色谱图，计算苯峰面积的相对标准偏差RSD，试验结果如表8所示。结果表明：苯峰面积的RSD小于5.0%，该方法的进样精密度良好。

4.2.4 检测限及定量限

取对照品溶液2，稀释至一定浓度，分别以信噪比S∶N=10∶1及3∶1时的浓度作为定量限及检测限，试验结果如表9所示。

4.2.5 线性与范围

根据定量限结果，配制苯的定量限溶液；分别精密量取0.5 mL、0.8 mL、1.2 mL对照品母液2置100 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，作为浓度梯度溶液；精密量取各浓度梯度溶液1.0 mL，分别置10 mL量瓶中，用25%DMF稀释至刻度，摇匀，作为线性试验溶液；顶空进样，记录色谱图，以浓度C（μg/mL）为横坐标，峰面积As为纵坐标，进行线性回归，试验结果如表10所示。

结果表明：在一定浓度范围内，苯的峰面积与浓度间呈现良好的线性关系。

表7 专属性试验结果

表8 进样精密度试验结果

表9 检测限与定量限试验结果

表10 线性试验结果

4.2.6 重复性试验

取本品（160402批）约1.0 g，精密称定，置于10 mL量瓶中，精密加入1.0 mL对照品贮备液2，用25%DMF稀释定容，摇匀，作为试验溶液，平行制备6份。分别精密量取对照品溶液及供试品溶液5 mL，顶空进样，记录色谱图，按面积外标法计算苯的含量，试验结果如表11所示。

表11 重复性试验结果

结果表明：该方法的重复性良好。

4.2.7 回收率试验

精密称取本品（160402批）9份，每份约1.0 g，分别置于10 mL量瓶中，精密加入1.0 mL 80%、100%、120%三个浓度级别的对照品贮备液2，用25%DMF稀释定容，摇匀，作为80%、100%、120%试验溶液，每个浓度级别平行制备3份。精密量取对照品溶液及各浓度级别试验溶液，顶空进样，记录色谱图，按面积外标法计算并扣除本底，试验结果如表12所示。

表12 回收率试验结果

结果表明：苯的回收率结果良好，该方法的准确度高。

4.3 供试品测定

依法测定1504011、1504021、1504031、1504012、1504022、1504032、160401、160402、160403、160501共10个批次的尿多酸肽注射液，均未检测出苯。

5 结语

尿多酸肽注射液在合成过程中，使用了大孔树脂吸附工艺，经与树脂供应厂家沟通，树脂中可能存在的有害残留物为苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯等。本文通过对10个批次的尿多酸肽注射液样品进行检测，证明该工艺生产的尿多酸肽注射液中不存在大孔树脂有害残留物。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：393-394.