论新技术在食品微生物检验检测中的应用

□ 郭 慧 鄂尔多斯市药品医疗器械检验研究中心

在现代社会中，伴随着人们生活水平的提高以及食品行业的快速发展，人们对食品安全的要求日益提高，再加上最近几年来食品安全问题频发，使得食品安全问题成为了人们关注的焦点问题。无论是在传统的发酵食品还是在现代的新型发酵产品中，都可能潜在微生物等，每年由于微生物而造成的食品安全问题时有发生。公众的关注点已不再仅停留在食品的安全问题上，开始逐渐转向对食物的营养健康评价，如对褪黑素、膳食补充剂、银杏叶提取物等保健食品及对糖等常见基础食品原料的关注。对此，运用快速检测食品微生物的方法检测食品安全具有十分重大的意义。本文简单介绍和分析了几种新型的且具有发展潜力的食品微生物快速检测方法及其应用。

1 分子生物学技术在食品微生物检测中的应用

所谓分子生物学技术，是指在基因水平上对目标微生物进行检测，特别是对于一些难以培养或者抗原结构较为复杂的微生物，可以对其进行鉴定和分型。此种方法最早是在1996年应用于食品微生物的检测检验中。分子生物学技术主要包括常规PCR及其衍生技术、核酸探针技术以及基因芯片等技术。

1.1 常规PCR技术

所 谓 PCR（Polymerase Chain Reaction）技术，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。由于其特性，它在20世纪末就已经被广泛应用到食品微生物的检测中。目前，PCR技术在食品微生物检测中被用于乳制品的乳酸菌和双歧杆菌的精确检测和鉴定、酒类中酵母菌的检测以及水源中大肠杆菌及其群体的测定等[1]。

1.2 PCR衍生技术

随着科学技术的不断发展，许多新技术也相继出现，PCR技术在发展的过程中不断和其他技术相结合，形成一些新的PCR衍生技术。比如，实时荧光PCR技术（qRT-PCR技术）、PCR变性梯度凝胶电泳技术（PCRDGGE技术）、多重引物PCR技术（Multiplex-PCR技术）以及环介导等温扩增技术（LAMP）等。

1.2.1 实时荧光PCR技术

qRT-PCR实时荧光技术最早在2006年被应用在食品细菌的检测领域中，相较于常规的PCR技术而言，其具有特异性强、污染程度低以及自动化程度高等优势，该技术在最近几年来已经被广泛应用到致病的细菌、霉菌、酵母以及乳酸菌重要食品微生物的定性和定量指标的检测和鉴定中[2]。

1.2.2 PCR-变性梯度凝胶电泳技术

PCR-DGGE技术，即PCR-变性梯度凝胶电泳技术，是把PCR技术和变性梯度凝胶电泳分析技术联合起来形成的一种新型检测技术，理论上，只要保证具有足够精细的电泳技术，即使只有一个碱基差异的DNA片段也可以被分开。由于PCR-变性梯度凝胶电泳技术具有可以检测不可培养的细菌、检测率高、重复性强等优势，现在已经被广泛应用于发酵类食品、酿酒等食品微生物检测以及群落研究中。

1.2.3 多重引物PCR技术

多重引物PCR技术（Multiplex PCR技术），又称复合PCR技术，它是在同一PCR反应体系中再加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。和传统的PCR技术相比较而言，它具有更高效的优点。现在该技术更多应用在食品病原微生物的检验检测中。病原性食品菌主要包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌以及副溶血性弧菌等。除此之外，该技术还可以被应用到乳酸菌等食品非致病菌的检测中。

1.2.4 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术，又称LAMP技术，是在2000年新开发的一种核酸扩增技术，现在已经被应用到食品细菌、真菌以及寄生虫的检测领域中。

1.3 核酸探针技术

随着分子生物学和分子化学的快速发展，对病原微生物的检测和鉴定已经不仅仅局限于外部的形态结构和生理特性等检验，而是更深入地从分子生物学水平角度对生物大分子进行研究，在此基础上建立的多种检测技术，核酸探针（Nuclear Acid Probe）以其快速便捷而灵敏特异的优势而成为生物技术革命的新产物，已经在病原微生物的检测中得到广泛应用。

核酸探针技术是通过同位素或者其他方法标记已知的核苷酸序列的DNA片段，加入已变性的被检DNA中，在一定条件下会与该样品中的同源序列DNA区段形成杂交双链，从而实现鉴定样品中DNA的目的。这种可以特异识别特异性核苷酸序列标记的单链DNA分子又被称为核酸探针或基因探针。依照核酸分子中核苷酸的成分差异，可以分为DNA探针和RNA探针，一般而言采用的是DNA探针。而依据基因的不同也可以分为两种，一种是可以同微生物整个DNA分子的一部分发生反应的探针，它对某些菌属、菌种具有特异性。另一种探针可以针对同一种微生物某一基因组的DNA进行杂交反应，比如，编码致病性的基因组，它只对某一微生物的菌株或者仅对某一微生物的菌属有特异性，此种探针检测的基因比较保守，因为它既可以在一种微生物中出现，也可以代表一大类群的微生物。

2 生理生化技术在食品微生物检测中的应用

生理生化技术，也可以称为代谢学技术，它是利用菌体在代谢过程中产生的特异物质和分子等变化的特点，对菌种进行检测的方法，主要包括ATP生物发光法和微量生化法。

2.1 ATP生物发光法

腺苷三磷酸（ATP Adenosine Triphosphate）是由腺嘌呤、核糖和3个磷酸基团连接而成，水解时释放出能量较多，是生物体内最直接的能量来源。它存在于所有活体的生物体中，因此，可以通过测定样品中的ATP浓度来检测食品中的细菌数。ATP生物发光法就是利用发光光度计在ATP作用下检测荧光素酶氧化荧光素所产生的荧光强度来测定菌量，其相比于传统的方法具有快速简便的优势，还能被应用到大量食品样本的菌类污染情况和食品现场的快速检测等。

随着科学技术的发展，ATP生物发光法在最近几年来在食品检测领域中主要被用于乳制品中乳酸菌的检测、啤酒中菌落总数的检测以及调味品中脱水蔬菜的细菌测定等。

2.2 微量生化法

微量生化法包括微热量技法、放射测量法等，前者是通过菌类在生长过程中所产生的热量变化来鉴定菌种的方法，而放射测量法则是把菌中成长所需要的碳水化合物通过微量的放射性标记物对其进行标记，然后通过测定菌种在生产过程中所产生的CO2浓度计算出食品中的菌量，这种方法具有快速性与高精确性等优势。

除了以上所提及的两种技术之外，还有电子阻抗法、接触酶测定方法，它们凭借所具有的独特优势而被广泛应用于食品细菌方面的检测。电子阻抗法因其具有高灵敏性、快速便捷性以及重复性高等特点，而被广泛应用到食品微生物的快速检测中，适合用于大肠杆菌、乳酸菌和酵母菌等的定量检测。

3 免疫学检测技术在食品微生物检测中的应用

免疫学检测技术是一种基于抗原-抗体的特异性反应而形成的一种检测方法，主要是以目标微生物的某个特异性基因的表达产物为对象。主要可以分为免疫磁性分离技术、酶联免疫吸附技术、免疫荧光技术以及免疫层析技术等，免疫学检测技术所具有的高效性和特异性，使得该技术在未来的食品微生物检测中具有良好的发展空间。

3.1 免疫磁性分离技术

近几年来，免疫学技术发展形成一种新型的技术——免疫磁珠，该技术结合了固化试剂所具有的优点以及免疫学反应的高度特异性，具备高效、快速、操作性强、重复性高与成本低等优点。

当前，免疫磁性分离技术已被广泛应用在食品样品的致病微生物的检测中，同时，由于该技术具备强特异性和下游良好的检测技术已经在多数细菌、真菌和酵母菌等主要食品微生物的快速检测中得到广泛应用。

3.2 酶联免疫吸附技术

酶联免疫吸附技术，即ELISA技术，它是将抗原、抗体反应间的特异性以及酶的高效性结合起来的一种新型检测技术。这种技术可以定性定量地测定待测物。

该技术采用方法有间接法、竞争法与双抗体夹心法，前两种方法多用于临床诊断中，而后一种方法则是应用在小分子抗原的测定上，在食品安全检测中具有较为广泛的应用。利用单抗体克隆双夹心法使得对海产品中副溶血性弧菌的灵敏度提高了近千倍。酶联免疫吸附技术还可以同荧光分析技术相结合应用在乳制品的检测分析中。

4 质谱与核磁共振技术在食品微生物检测中的应用

在后基因时代，许多基因类的学科理论，比如，转录组学、蛋白质组学以及代谢组学等新理论，也给新技术的产生提供了一定的理论和技术的支持。这里主要介绍质谱法与核磁共振技术，它们在食品微生物的快速检测中具有较大的发展空间。

4.1 质谱技术

当前质谱技术主要应用在海产品中的腐败菌的快速检测以及革兰氏阳性致病菌等菌种的测定。首先对样品中的病菌进行分离，然后利用质谱对其进行鉴定，建立含有多个标准菌类的光谱指纹图谱的提取峰表，属特异性和种特异性的峰质量数则可以被当作快速检测细菌的生物标记。同时，质谱技术还可以应用于发酵型食品的菌种的检验和测定，其不仅能够对动物源双歧杆菌的种类进行鉴定和区分，同时它也可以实现工业的快速检测。

在当前的食品微生物检测中，质谱法中的液相色谱分离技术以及电子喷雾三重四极杆的质谱联用是较为常见的，通过这些技术的合理使用可以快速地检测出水果蔬菜、奶类肉类以及酒水中的菌类污染情况。作为新兴技术，质谱技术已经在食品安全检测中具备一定的基础，由于该技术具有快速检测、操作便捷以及成本消耗低等优势，在食品微生物检测中具有良好的发展空间。

4.2 核磁共振技术

从当前核磁共振在食品微生物检测中的应用看，由于其具备快速精确且不会对原料造成损坏等优点，其在乳制品中存在的乳酸菌检测中通过对其进行跟踪标记，从而实现定性和定量的测定，同时，它也能对酒类的酵母菌以及蔬菜水果中存在的霉菌进行检测，在食品安全检测中得到广泛应用。

5 结语

近年来不断出现食品安全问题，使得民众对食品的安全越来越重视，同时，食品微生物的快速检测方法在食品安全和食品卫生检验中得到越来越广泛的应用，分子生物学、生理生化学、免疫学、质谱技术等都可能成为未来食品微生物快速检测的有效方法，这些不断创新的新兴技术由于具备快速灵敏等优点将在微生物检测中发挥重要的作用。

[1]邓军.食品微生物检验检测中新技术的应用[J].粮食流通技术,2016(17):77-79.

[2]杨丹,郎慧柯.PCR技术在食品微生物检测中的应用价值[J].食品安全导刊,2017(30):96.