燕麦食品蛋白质含量检测

□ 邱 纯 佛山市质量计量监督检测中心

1 前言

因质谱仪分析大分子量蛋白质的灵敏度较分析小分子量的胜肽低，故使用酵素对蛋白质进行专一性的水解反应，将大分子的蛋白质切成小片段胜肽，消化为适当的大小及长度（以6～20个胺基酸组成的胜肽最适合），利于仪器作出精确的判断。胰蛋白酶Trypsin是最常使用于蛋白质分解的蛋白酶，易于纯化、产量高且专一性强，Trypsin剪切赖氨酸Lysine和精胺酸Arginine的碳端（C端）位置，但若与C端连接的胺基酸为脯胺酸Proline，则不水解此键结。许多蛋白质中富含Lysine及Arginine，则Trypsin水解后的胰蛋白胜肽片段（Trypticpeptide），便于送入后续的质谱仪分析，这也是Trypsin被广泛使用的原因。

2 药品与仪器

2.1 实验药品

触媒、氢氧化钠、柠檬酸；指示剂、己烯；30%丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、催化剂、过硫酸铵等。

2.2 仪器

热风循环烘箱、蛋白质分解炉、燃烧式氮测定仪、索氏萃取装置、高温灰化炉、电泳槽组、电泳电源供应器、高速均质机、回转式振荡器、微量高速低温离心机、高速离心机、干浴器、微电脑酸碱度计、超声波水浴槽、蛋白质减压浓缩系统、超高效液相层析仪（UPLC）与双线性离子阱组合傅立叶变换轨道阱质谱仪。

3 实验方法

3.1 粗蛋白质

使用水分测定后干燥完成的样品，秤取样品约0.5 g于燃烧式氮测定仪专用的锡箔纸中，封口成形后置入燃烧式氮测定仪中高温燃烧。燃烧过程中生成氮氧化物、二氧化碳、水及无机物，经过一系列吸收剂去除二氧化碳、水及无机物，氮氧化物经还原管被还原为分子氮，最后经热导检测器检测出氮分子含量（N），乘以蛋白质系数5.95，即可得粗蛋白质含量。

粗蛋白质含量（%）=N×5.95%

3.2 蛋白质检测

在微量离心管中加入80 μL清洗溶液清洗胶体碎片，振荡1 min，再用微量吸管移除清洗溶液。重复加入清洗溶液和移除溶液2次，尽量移除微量离心管中的溶液。接着加入15 μL二硫苏糖醇溶液，静置10 min，让胶片吸收溶液，将微量离心管放入干浴器中于55 ℃下反应30 min。使用微量吸管移除溶液，再加入15 μL碘乙酰胺溶液，放置在黑暗环境中于室温下反应60 min。吸除微量离心管中的溶液，加入100 μL清洗溶液后振荡，重复吸除溶液并加入清洗溶液直到微量离心管中的胶片碎片变成透明无色。使用蛋白质减压浓缩系统，将微量离心管中的溶液完全抽干后，加入15 μL胰蛋白酶溶液与10 μL的25mM缓冲溶液，放入37 ℃水浴槽中反应6 h，使蛋白质分解产生胜肽[1]。

3.3 液相层析串联质谱仪分析

流速为10 μL/min；使用二次水和乙腈作为移动相，起始移动相为98%二次水、2%乙腈，在50 min内将移动相内乙腈浓度升高至95%。

游离源设定为正电模式、温度为90 ℃、电压则是2.8 kV；质谱扫描范围设定为350～2 000 Da，收集2+至6+离子讯号。

4 结果

燕麦脱脂粉末及其酸、碱蛋白质分离物与上清液的电泳分析结果，于约50 kDa处对应为11Sglobulin（Chenopodin），其由A、B两个次单 元（Subunit） 所 组 成，A-subunit分子量为 30～ 40 kDa、B-subunit分子 量 为 20～ 25 kDa。A、B Subunit会于后续的合成步骤形成Chenopodin（约50 kDa）。其中碱萃取（BP）及酸萃取（AP）蛋白质分离物的Lane，皆于28～35 kDa处有两条明显的Band、20～25kDa处有三条明显的Band，推测其各对应为11Sglobulin A、Bsubunit，于约50 kDa处也可发现Chenopodin的存在。

5 结论

以碱萃取方式所得的燕麦蛋白质分离物，较酸萃取方式具较高的蛋白质含量（94.25%）及产率（32.29%）。蛋白质体学的质谱技术用于检测燕麦中的蛋白质，液相层析串联质谱仪分析出的Trypticpeptide对应于四种蛋白质：11S种储存球蛋白、GBSSIb蛋白、乙酰羟酸合成酶（AHAS）、甜菜碱醛去氢酶（BADH）。通过质谱技术得知蛋白质序列搭配生物信息工具，可以分析序列中的活性胜肽，探讨实验素材用于生产活性胜肽的潜力，可以减少实验时间和药品、材料的浪费，并有助于从蛋白质中生产特定活性的功能性胜肽。

[1]李景梅.偶氮氯膦-Ⅲ分光光度法测定蛋白质[J].吉林大学学报(理学版),2015(6).