成熟液成分对卵母细胞体外成熟培养影响的研究进展

王 晨，王浩晨，周雪雁

（1．西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030；2．浙江大学医学院，杭州 310058）

卵母细胞体外培养的成熟为动物人工辅助生殖领域拓宽了前景，体外受精、核移植、器官移植等胚胎工程技术的研究和应用越来越广泛，卵母细胞体外培育的质量是决定胚胎生物工程研究和应用成败的关键因素之一，但至今卵母细胞体外培养的效果仍然不稳定［1］。 朱平川等［2］研究发现不同培养基对卵母细胞体外发育有重要影响，赵晓娥等［3］研究发现很多生长因子对卵母细胞体外发育率有不同的影响。

1 基础培养基对卵母细胞体外成熟培养的影响

TCM199是目前卵母细胞体外培养中使用最广泛的一种基础培养基，TCM199中培养的绵羊卵母细胞形态良好，极适宜进行下一步试验。在绵羊体外受精的TCM199渐变培养体系中发现利用TCM199体外受精渐变培养体系的试验组和对照组成熟率差异不显著，但是能显著提高绵羊卵母细胞体外受精后的卵裂率和桑囊率。在小鼠卵母细胞体外培养研究中，M2和M16培养液均为实验室体外培养细胞的常用试剂，其中M2培养液是由M16培养液改进而来，由于两者所用的缓冲液不同，导致两者培养液具有不同的pH。M2培养液微偏酸性，M16培养液微偏碱性。经试验研究表明，在运用M2和M16两种不同培养液进行小鼠卵母细胞培养时，M16培养液中培养成熟率明显高于M2培养液中培养成熟率［2］。

2 动物血清对卵母细胞体外成熟培养的影响

在基础培养基中添加动物血清是动物细胞体外培养中最重要的一部分，动物血清对卵母细胞成熟有着至关重要的作用，可能与动物血清中化学成分尚不明确的诸多生长因子有关。唐业刚等［4］研究得到成熟液中添加血清与否对卵母细胞体外成熟率无明显影响，但是含有血清的培养液中的卵母细胞随后的受精卵显著高于无血清组。有研究者认为血清的来源动物种类以及动物所处时期对卵母细胞培养有一定影响，尤其是发情期动物的血清。发情3 d羊血清对绵羊体外受精卵裂率囊胚率有明显提高，故发情3 d的绵羊血清更适合绵羊的体外受精。原因可能是因为发情期的绵羊血清中含有大量的FSH等激素。

唐业刚等［4］认为血清并非水牛卵母细胞体外细胞成熟所必需，其采用EH和6DMAP联合处理也可达到卵母细胞成熟的效果，且与加血清组成熟率无显著性差异。张立苹等［5］研究发现添加PVA的成熟液培养猪卵母细胞成熟率与血清（FBS）组无显著性差异，故可以用PVA代替FBS。但是在使用EH或PVA代替血清时都需添加或大量添加细胞生长所需的激素与生长因子。

3 激素对卵母细胞体外成熟培养的影响

激素作为动物卵母细胞体内外培养的研究重点，许多研究者已经证明，促性腺激素能够促进哺乳动物卵母细胞的体外成熟，促卵泡生成素（FSH）和黄体生成素（LH）是卵母细胞体外培养成熟液中最常用的2种促性腺激素，还有研究者发现用雄二醇E2和孕马血清促性腺激素PMSG也可在体外促进卵母细胞成熟。

FSH和LH是由垂体分泌的两种促性腺激素（Gn）。在正常的排卵周期中，FSH和LH协同发挥作用，对调控卵泡生长、卵母细胞成熟、排卵、黄体形成以及甾体激素分泌产生重要影响。研究表明FSH可以诱导卵丘细胞扩散，这是卵母细胞成熟的前提条件。FSH能促进卵丘细胞增殖分化、向外扩展并刺激卵丘细胞产生一种能促进卵母细胞成熟的细胞因子。FSH还能克服一定浓度Hx、IBMX、dbcAMP等对绵羊卵母细胞成熟的自发抑制，诱导绵羊卵母细胞恢复减数分裂成熟。

张涛等［6］研究表明，LH对山羊卵母细胞的体外成熟有一定的促进作用。目前的卵母细胞体外培养试验中大多为FSH、LH联合使用，经试验得到成年母羊（牛）卵母细胞成熟培养时，在成熟液中添加浓度为10．0 ug／mL的FSH和LH，成熟率明显提高。

4 生长因子对卵母细胞体外成熟培养的影响

大量的试验证明在动物卵母细胞体外培养中，尤其是在无血清的动物卵母细胞培养成熟液中添加适量生长因子对卵母细胞成熟以及早期胚胎发育有重要作用。所添加的生长因子大多数是动物血清中所含有的物质，如 EGF（表皮生长因子）、IGF－I（胰岛素样生长因子－I）、GDNF（神经胶质源营养因子）、LIF（白血病抑制因子）、SCF（干细胞因子）、VEGF（血管内皮生长因子）等，这些生长因子对卵母细胞的体外培养有极大影响。

EGF（表皮生长因子）是一种局部调节因子，存在于动物体的体液和组织中，具有生物学的作用。有众多研究指出，EGF有促进卵母细胞成熟的作用，鲁进等［7］研究发现添加EGF的成熟液培养山羊卵母细胞的成熟率有所提高，但是添加量在30 μg／L以下对山羊卵母细胞体外成熟无显著性影响。IGF－I可以诱导颗粒细胞LH受体的表达，但是在赵晓娥等［3］的研究中显示培养液中添加IGF－I后山羊卵母细胞成熟率明显高于对照组，尤其是EGF和IGF－I的联合使用，显著高于对照组卵母细胞成熟率。

GDNF、LIF和SCF在动物卵母细胞培养中一般为联合使用，研究表明GDNF、LIF和SCF对山羊卵母细胞体外成熟有显著影响，单独使用SCF、LIF、GDNF浓度分别为 10、10、15 IU／mL时山羊卵母细胞成熟率最高。当三者联用和GDNF＋LIF组效果最好，山羊卵母细胞成熟率均高于单独使用或其他两两组合的成熟率。

5 抗生素对卵母细胞体外成熟培养的影响

抗生素作为一类抗菌性药物广泛用于预防和治疗人类和动物疾病，在动物细胞培养中为了降低细胞受到污染而停止生长甚至死亡的发生被广泛使用，目前主要使用的为青霉素、链霉素与离子霉素。多数研究者利用添加50 IU／mL青霉素与50 μg／mL链霉素的成熟液培养绵羊卵母细胞。

目前暂未出现青霉素、链霉素浓度对卵母细胞体外培养成熟率的研究结果，但是谭景和等［8］研究表明，高浓度（100 IU／mL）的青霉素可大大降低卵母细胞的孤雌活化率，但是适当浓度（50 IU／mL）的青霉素可使活化率出现一个峰值，故推测高浓度的青霉素可能使其成熟率降低，但是适量青霉素浓度会使其出现一个最大值。

虽然抗生素可有效避免污染的产生，但是抗生素并不是正常动物机体内环境中所含有的物质，添加抗生素会使体外培养卵母细胞的环境与正常环境有所差别，且在添加抗生素的情况下卵母细胞的成熟率是否会发生改变均有待考证。

6 含巯基化合物对卵母细胞体外成熟培养的影响

GSH（巯基乙胺）在动物细胞中有抗氧化和减少损伤的作用，在成年动物卵母细胞中GSH含量的增加发生在排卵前，并且羔羊卵母细胞合成GSH能力显著低于成年羊。由此推测在成熟液中添加含巯基化合物（如胱氨酸、半胱氨酸、巯基乙胺和β－巯基乙醇）能够提高细胞中GSH浓度，进而提高卵母细胞成熟率。研究显示，添加100μmol／L巯GSH能显著提高羔羊卵母细胞细胞核和细胞质的成熟能力。虽然成熟液中添加β－巯基乙醇对羔羊卵母细胞成熟率、胚胎卵裂率影响不显著，但是对囊胚率影响极显著。

7 展望

动物卵母细胞在体外成熟培养是一个极其复杂的过程，其影响因素不仅仅局限于动物卵母细胞培养成熟液的成分，其成熟还与样品来源动物的品种、采样年龄、采卵方式和采卵季节有关，且卵泡的直径大小对动物卵母细胞体外成熟也有影响。应该如何建立更加完善的卵母细胞体外培养环境体系进而模拟出与动物机体内卵母细胞所处环境，对提高卵母细胞体外培养成熟率和推动动物胚胎工程发展的进程有举足轻重的作用。

［1］岑 文．猪卵母细胞体外成熟培养及孤雌胚胎体外培养的研究［D］．西安：陕西师范大学，2015．

［2］朱平川，肖 艳．卵巢低温保存时间与不同培养液对小鼠卵母细胞体外发育的影响［J］．黑龙江畜牧兽医，2016（11）：221－223，289．

［3］赵晓娥，李向臣，高立功，等．山羊卵母细胞的体外成熟研究［J］．中国农学通报，2005（9）：1－3，16．

［4］唐业刚，李跃民，武建中，等．血清对水牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎发育的影响［J］．动物医学进展，2005（11）：98－101．

［5］张立苹，王亚刚，李 莉，等．成熟液中不同添加物对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响［J］．湖北农业科学，2009，48（10）：2502－2505．

［6］张 涛，刘 超，吕丽华．LH和hCG对山羊卵母细胞体外成熟的影响［J］．畜禽业，2009（4）：40－42．

［7］鲁 进，刘凤军，王勇胜，等．EGF和IGF－1对山羊卵母细胞体外成熟的影响［J］．黑龙江畜牧兽医，2005（3）：7－9．

［8］谭景和，秦鹏春，马 骥．卵龄和培养液中青霉素浓度对小鼠卵母细胞酒精孤雌活化效果的影响［J］．细胞生物学杂志，1988（2）：69－72，98．