皮肤微生物多样性与相关疾病研究进展

翟婉芳 唐先发 杨 森

皮肤是机体与外界环境间的重要屏障，既可以防止水分流失和病原体侵入，也寄生着复杂多样的微生物群落，包括细菌、古生菌、真菌、病毒及螨虫类。以往我们对机体各部位微生物群的认识基于传统培养法，根据菌株表型特征进行分类鉴定，已从正常皮肤分离培养出葡萄球菌属、微球菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、丙酸杆菌属和不动杆菌属[1],但因实验室不能完全再现微生物的自然生存条件，以及优势菌种抑制小种群生长，使得传统培养法在微生物多样性认识上受到局限[2]。近些年随着高通量DNA测序技术逐渐成熟，以及有助于序列识别的数据库扩增，不仅证实了已知微生物物种，更鉴定了新物种，增加了对机体各部位微生物群多样性的认识[3]。而对皮肤微生物的深入研究为将来认识微生物与宿主、环境以及微生物群落间的相互作用奠定了基础。该文针对近些年利用现代测序技术鉴定健康人及疾病相关的微生物多样性(尤其是细菌)的研究进展作一简要综述。

1 皮肤微生物的现代测序技术

皮肤微生物样本的采集方式包括无菌棉签擦拭[1,4-6]、无菌刀刮屑[6,7]和活组织检查[6,8]这三种采集法获得的微生物群落结果无明显差异[6]，拭子法因快速简便、侵袭性小广泛应用，而只在研究皮肤深层环境微生物时才考虑活组织检查[9]。样本采集后常于-20℃、-80℃或液氮中冷冻储存留待DNA提取[10]。大多数DNA提取过程经历细胞裂解、去除非DNA大分子和收集DNA，为充分裂解细胞常联合运用化学、物理和机械法，商业的DNA提取试剂盒(如Qiagen DNeasy DNA Extraction kit, MOBIO Power Soil DNA Isolation kit )也被广泛应用[9]。

DNA成功提取后的关键步骤是根据鉴定的微生物类别选择靶基因进行PCR扩增，并对PCR产物测序分析。鉴定细菌及古生菌时选取的靶基因为16SrDNA[1,4,8,11]，系编码原核生物核糖体小亚基的基因，包括保守区及高变区，保守区用于设计PCR扩增引物，高变区用于系统发育分类，鉴定真菌时选取的靶基因可为18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA以及内转录间隔区(ITS)基因[5,7,11]，病毒因缺乏保守区难以形成扩增子，通常采用全基因组鸟枪测序法，即给定样品的DNA随机打断成小的片段，分别测序形成短序列，再基于重叠关系拼接成一条一致序列。目前应用的测序技术有一代的Sanger测序(如Applied Biosystems 3730xlDNA分析仪)和高通量焦磷酸测序(如Roche 454 Genome Sequencer GS,FLX,FLX Titanium)、Illumina微阵列(如Illumina Solexa,HiSeq2000,MiSeq)。测序完成后需对数百万的序列进行生物信息分析，常用的生信分析管道有QIIME,mothur,MetaPhlAn，以及可视化软件包如MEGAN，Krona，MGAviewer和MetaSee，从而进行序列归类和操作分类单元(OTU)划分、构建系统发育树、生境内物种多样性(α多样性)和生境间物种多样性(β多样性)评估[9,10]。但因真菌和病毒的基因序列数据库和分析软件工具有限，对其研究还有待于进一步发展。

2 健康人皮肤微生物

2.1 细菌 根据皮肤生理特性不同，将其分为湿性(腋窝、肘窝、腘窝、腹股沟等)、干性(掌前臂、小鱼际等)及油脂区域(眉间、后背、外耳道等)，使用16S rRNA基因系统发育对居住在不同皮肤生境的细菌多样性进行分析，揭示了宿主栖息地对细菌群落的形成有决定性作用。细菌在门水平上无区域差异，分为四种优势菌，即放线菌门、厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门，而在种水平上存在显著差异，油脂区域以丙酸杆菌种和葡萄球菌种分布为主，湿性区域优势菌为棒状杆菌种，其次为葡萄球菌种，而干性区域有更大的细菌多样性，β-变形菌和黄杆菌是其中的一部分[4]。对油脂及干性区域接种外来菌，观察2 h,4 h,8 h后局部菌群变化，发现油脂区域可通过促进原生菌繁殖，抑制外来微生物的生长维持局部微生态屏障的稳定，有更稳定的细菌群落构成[12]。

其他宿主因素也参与皮肤菌群形成，如年龄、性别、种族等。胎儿皮肤是无菌的，于分娩过程中出现微生物定植，经阴道分娩的新生儿皮肤细菌群落与母亲的阴道微生物相似，主要是乳杆菌属、普雷沃菌属或纤毛菌属，而剖腹产的新生儿皮肤菌群类似于成人皮肤微生物，以葡萄球菌属、棒状杆菌属和丙酸杆菌属为主[13]。出生后皮肤结构及功能逐渐成熟，皮肤细菌群落于婴儿期形成发展，随着年龄增加低优势菌属丰度增加，而占优势的葡萄球菌属和链球菌属丰度降低，呈现更大的菌群多样性，并表现出类似于成人的区域分布特征[14]。成年人的皮肤菌群多样性显著高于青少年和老年人，同时菌群结构即不同分类群的相对丰度也存在年龄差异，如老年人的棒状杆菌属、水栖菌属丰度较高，而丙酸杆菌属、葡萄球菌属丰度较低。定植菌的年龄差异可能与皮肤营养和屏障功能的改变相关，如老化皮肤的结缔组织和外周血管萎缩，皮脂腺和汗腺分泌减少[15,16]。

女性表现出更高的菌群多样性，同时在菌群结构上也有性别差异，如丙酸杆菌属、棒状杆菌属的相对丰度男性高于女性，不动杆菌属、副球菌属、鞘脂单胞菌属的相对丰度女性高于男性。皮肤菌群的性别差异或许可以用男性和女性皮肤生理环境如激素代谢、排汗率、油脂分泌和酸碱度的差异解释[16]。

研究发现皮肤菌群的种族变化可能与某些低丰度分类单元(OTUs)的存在或缺失相关，同一皮肤部位低丰度OTUs的存在或缺失在种族间表现出显著差异，甚至高于其在种族内不同皮肤部位间的差异，而皮肤部位中丰度最高的菌群不存在种族差异。未来对低丰度OTUs的时间动态研究或许可以了解其在皮肤中扮演的角色，即暂驻菌还是常驻菌[17]。

除了宿主内在因素，宿主暴露的外环境也参与皮肤微生物的形成，对城市和农村居民皮肤菌群的研究发现两者的细菌丰度不同，其中特布尔西氏菌属在城市居民中有更高的相对丰度，而农村居民的微生物群落结构多样性显著高于城市居民。从事户内工作的城市居民皮肤微生物主要是人源性的，而从事户外工作的农村居民皮肤微生物可能受土壤、水栖和宿主相关微生物的影响[16]。

2.2 其他微生物 大多数微生物研究关注于皮肤细菌群落构成，但存在于皮肤栖息地的微生物不限于细菌。已经培养出的皮肤共生真菌有马拉色菌属、红酵母属、德巴利酵母属、隐球菌属和假丝酵母属。现代测序技术了解到皮肤真菌群分布同样具有区域差异性，躯体近心端及手臂的优势真菌为马拉色菌属，其中外耳道、耳后皱襞及眉间以限制性马拉色菌为主，后背、枕部和腹股沟以球形马拉色菌为主，而鼻孔、肘窝、掌前臂和小鱼际表现为限制性马拉色菌、球形马拉色菌和合轴马拉色菌共存，足底则呈现出复杂的菌群多样性，除马拉色菌属外，还包括曲霉属、隐球菌属、红酵母属、附球菌属。而健康人皮肤表面也检测到致病真菌，如季也蒙毕赤酵母、阿氏丝孢酵母、互隔交链孢霉和出芽短梗霉[7，11,18]。

病毒常被视作病原体，但DNA测序技术发现健康人皮肤表面定植着复杂的病毒群，有乳头瘤病毒科、多瘤病毒科和圆环病毒科，乳头瘤病毒科以β和γ乳头瘤病毒为主，多瘤病毒科主要是默克尔细胞多瘤病毒、人多瘤病毒[6，7，9]，而圆环病毒科主要是圆环病毒NG12[19]。

3 皮肤疾病与微生物

3.1 特应性皮炎 特应性皮炎患者皮损区及周围正常皮肤均可培养出金黄色葡萄球菌，通过分泌一些毒性物质，如超抗原SAgs、α溶血素、δ毒素等增加疾病的严重程度[20]，而金黄色葡萄球菌的易感性可能与皮肤物理屏障失调及抑制微生物生长的皮肤天然免疫防御系统缺陷相关。炎症刺激角质形成细胞后产生抗微生物肽HBD-2、LL-37，是皮肤天然免疫系统的关键组分，对特应性皮炎皮损区组织病理进行免疫组化和实时定量PCR均证明了这种抗微生物肽的表达缺陷[21]。利用DNA测序技术对疾病稳定期、发作期和治疗后的皮损区进行皮肤细菌群鉴定，与稳定期和治疗后相比，发作期菌群多样性降低，链球菌属、丙酸杆菌属和棒状杆菌属减少，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌增加，除外还检测到低丰度属如罗氏菌属在三种疾病状态中增多[22]。这些研究可以解释临床上局部或系统性应用抗生素及稀释漂白浴治疗特应性皮炎，目的是减少微生物负荷[23]。

而对轻中重度的特应性皮炎患者皮损区进行真菌群研究，发现皮损区存在马拉色菌微生物群、非马拉色菌的酵母菌群及丝状真菌微生物群。马拉色菌群以限制性马拉色菌和球形马拉色菌为主，与正常皮肤无异，但疾病严重程度不同两者比例不同，轻中度者以限制性马拉色菌更占优势，重度患者两者比例相当。与正常皮肤相比，皮损区的非马拉色菌酵母菌群显示出更大的物种多样性，白色念珠菌、异常威克汉姆酵母、液化隐球菌和阿氏丝孢酵母的检出率更高，而丝状真菌群中的枝孢菌和Toxicocladosporium irritans仅在特应性皮炎皮损区中检测到[7]。此外，还发现特应性皮炎患者有更高的播散性病毒感染风险，如传染性软疣病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒等[24]。

3.2 银屑病 银屑病是一种慢性红斑鳞屑性皮肤病，培养法发现银屑病患者皮损区及鼻孔中的金黄色葡萄球菌及产毒菌株增加[25]。利用DNA测序技术对银屑病患者皮损区采取无菌棉签擦拭或组织病理的方式进行细菌种群鉴定，均显示银屑病与细菌群落构成及优势菌的改变相关，皮损区在门水平上的优势菌为厚壁菌门、放线菌门和变形菌门，其中厚壁菌门较正常皮肤增多，放线菌门较正常皮肤减少，不同的是拭子法得出变形菌门较正常皮肤减少，而组织病理相反，因为组织病理包括真表皮，拭子法仅是对皮肤表面的研究，两种采样方法造成的结果差异可能与存在于真表皮细胞、皮脂腺单位中的细菌相关。属水平上皮损区丙酸杆菌属降低，链球菌属与丙酸杆菌属的比例显著升高，种水平上皮损区痤疮丙酸杆菌显著减少，且物种丰度和均度下降[8,26]。一项对泰国银屑病患者皮肤微生物的研究发现仅从银屑病患者皮肤拭子中分离培养出链球菌[27]，尽管银屑病的治疗指南不再推荐链球菌干预治疗，但抗生素仍是斑块型银屑病急性发作的良好治疗手段，这是因为流行病学和体外研究实验均支持银屑病发作和咽部链球菌感染相关[28]。除了细菌改变，银屑病患者血清中尚存在糠秕马拉色菌诱导单核细胞分泌的Th1细胞因子，皮损区与健康皮肤均以马拉色菌属为优势真菌，但皮损区马拉色菌属具有较低的总体丰度，真菌群呈现更大的多样性[5,29]。

3.3 酒渣鼻 酒渣鼻是一种慢性炎性皮肤病，特征性表现为面部毛细血管扩张性红斑、炎症性丘疹和脓疱的组合。研究表明，患者面部皮损区有高密度的毛囊蠕形螨定植[30,31]，其致病机制包括激活免疫应答、反应性过度角化阻塞毛囊、异物肉芽肿形成和作为细菌载体[32]。现代测序技术对红斑毛细血管扩张型(ETR)和丘疹脓疱型(PPR)酒渣鼻患者蠕形螨相关的细菌进行鉴定，与正常皮肤及ETR相比，PPR患者皮损区放线菌门比例下降，而变形菌门和厚壁菌门比例升高，属水平上ETR及PPR的代表菌分别为嗜血杆菌属和埃希氏菌属，种水平上分别为Duganella zoogloeoides及Acinetobacter pitii，值得注意的是由于16SrDNA在芽孢杆菌种水平鉴定的局限性，未能鉴定出蔬菜芽孢杆菌[33]，但已知从毛囊蠕形螨身上可分离培养出蔬菜芽孢杆菌，其产生的蛋白质具有增加中性粒细胞迁移、脱颗粒和产生细胞因子的能力，引起毛囊皮脂腺周围炎症[34]。另外从PPR患者的脓疱中分离出表皮葡萄球菌的纯生长，因此局部皮肤血供及温度的增加可能刺激共生菌表皮葡萄球菌发展为病原菌，导致了丘疹脓疱型酒渣鼻的发生[35]。这些研究结果解释了临床上选择性应用抗生素可缓解丘疹脓疱型酒渣鼻患者面部炎症这一现象。

3.4 寻常型痤疮 寻常型痤疮是好发于青少年的一种毛囊皮脂腺的炎性病症，虽然对其病因和发病机理尚不清楚，但微生物的参与是疾病发展的重要机制之一。其中痤疮丙酸杆菌被认为是重要的致病因子，现代免疫荧光显微技术发现寻常型痤疮患者面部毛囊皮脂腺中有更高频率的痤疮丙酸杆菌定植，其形成的生物膜有抵抗抗生素的能力[36,37]，同时痤疮丙酸杆菌有强的免疫刺激性质，通过Toll样受体诱导角质形成细胞、皮脂腺细胞和单核细胞产生趋化因子和防御素[38]。研究者应用现代测序技术对比痤疮患者与健康人毛囊皮脂腺中的痤疮丙酸杆菌，其相对丰度无差异，但在菌株水平上有所不同，某些菌株和痤疮强相关，而某些菌株在正常人皮肤富集[39]。另一研究指出痤疮患者的毛囊皮脂腺中除了痤疮丙酸杆菌外还有表皮葡萄球菌和低比例的非培养菌群定植，这与健康人皮脂腺中单一的痤疮丙酸杆菌定植不同[38]。

4 宏基因组学与微生物

目前研究皮肤微生物广泛应用的技术是设计通用引物靶向核糖体基因(如16SrDNA、18SrDNA)完成体外扩增后测序，而要更好地理解皮肤微生物在防止病原体和改善人类健康的作用不能局限于物种的分类学鉴定，更需要了解与功能基因相关的特定代谢活动，这一目的可以通过宏基因组的高通量鸟枪测序法实现[40]。

宏基因组是对环境样品中全部微生物群的基因组进行分析，确定完整的遗传多样性及预测与微生物群相关的基因功能[41]。目前皮肤微生物的宏基因组关联分析还处于初步探索阶段，现阶段利用宏基因组学已了解到皮肤细菌主要参与分解代谢，如利用油脂作为碳源进行甘油三脂分解代谢，也参与皮肤酸度调节。皮肤微生物的代谢活动同样存在区域差异，油性区域表现为糖酵解途径活跃，产生过多的ATP、GTP以及NADH脱氢酶1过度表达，干性区域以柠檬酸循环为主[40,42]。

而利用宏基因组学已对肠道微生物及相关疾病进行了广泛研究，肠道微生物参与能量代谢、必需氨基酸和维生素(生物素、核黄素、硫胺素、泛酸盐、抗坏血酸盐)合成[43,44]。肥胖症与肠道细菌在门水平的改变，尤其是拟杆菌门和厚壁菌门，多样性降低以及细菌基因和代谢途径的改变相关[45,46]，2型糖尿病患者存在中度的肠道菌群失调，产生丁酸盐的细菌丰度降低，机会性病原体增加，参与的能量代谢、硫酸盐还原作用和氧化应激抗性反应增加[47,48]，而症状性动脉粥样硬化患者肠道富集柯林斯氏菌属，肽聚糖合成增加和八氢番茄红素脱氢酶减少，血清中的β-胡萝卜素水平降低[49]。

5 小结

该文总结了近些年应用现代测序技术研究健康人皮肤微生物组群以及与皮肤疾病相关的微生物改变，尽管分子学技术相较于培养法在微生物多样性认识上显示出更大优势，但所鉴定的微生物无法区分其活性，且难以确定暂驻菌和常驻菌。目前对改变的微生物是如何导致或加剧这些疾病仍知之甚少，未来对人皮肤微生物组的宏基因组学研究有待于发现微生物与宿主、微生物与环境以及微生物群落间的相互作用，从而开发新的治疗策略。

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