多能干细胞向雄性生殖细胞定向分化的研究进展

王新杰 姬小利 王敏 周君梅

生殖健康是人类社会得以继续繁荣发展和进步的关键和保证。男性不育是亟待解决的一大问题，其原因和机制有待研究，但因伦理限制，不能利用人类胚胎开展研究，因此在体外建立合适的研究模型成为解决问题的一种新思路。

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）是一种来源于早期胚胎囊胚阶段内细胞团的具有自我更新能力及多向分化潜能的细胞，可在体外定向诱导分化为三个胚层的各种类型成体细胞。已有研究表明，小鼠的ESCs可在体外诱导分化为成熟的单倍体精子，且这些精子可使卵子受精并得到存活的后代[1]。人的ESCs也可在体外诱导分化为生殖细胞[2]，但是，人ESCs的建立需破坏早期胚胎，将其用于生物医学研究存在伦理及技术限制等诸多制约[3]。2006年，诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的出现为解决以上难题提供了可能。iPSCs是多能干细胞的一种，通过在体外向成体细胞中导入与ESCs多能性密切相关的转录因子，诱导其重编程，可得到iPSCs。2006年，日本科学家首次将四种转录因子Oct3/4、Sox2、Klf4 和c-Myc通过逆转录病毒导入小鼠皮肤成纤维细胞，使之重编程后得到了具有ESCs特性的小鼠iPSCs[4]。2007年，该研究小组又通过同样的方法成功获得了人iPSCs[5]。同年，美国科学家用另外一组转录因子，即Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28成功地将人的皮肤成纤维细胞重编程，得到人iPSCs[6]。iPSCs的形态特征、增殖能力和分化潜能等均与ESCs相似，但具有ESCs不具备的以下优势：（1）其种子细胞来源广泛，包括皮肤成纤维细胞、神经干细胞、尿源性细胞、脂肪细胞、羊水细胞、肝细胞和角质细胞等[7]；（2）避开了破坏人类胚胎的伦理问题；（3）自体细胞的移植应用避免了免疫排斥问题。同时，由于ESCs与iPSCs均具备分化成多种成体细胞的能力，因此，可利用ESCs / iPSCs向生殖细胞分化为体外模型，研究人类生殖细胞的发育规律，在此基础上，建立带有人类疾病遗传背景的iPSCs模型，体外向雄性生殖细胞方向诱导分化，利用该模型来研究男性不育的发病机制。精子的形成是一个雄性生殖细胞分化、增殖和成熟的复杂过程，该过程可分为2个阶段：第1阶段是原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）形成，继之向精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）方向分化；第2阶段是SSCs向精子细胞方向分化，经过有丝分裂和两次减数分裂，最终形成成熟的精子[8]。该过程的不同阶段受到不同诱导因子的作用，因此，为了更好地在体外模拟精子的形成过程，诱导因子的选择及添加时间应根据以上生殖细胞在体内的发育规律而定、在不同发育阶段循序加入，从而达到更好地研究发病机制的目的，为维护和促进生殖健康奠定重要基础。

本文将对多能干细胞向雄性生殖细胞定向诱导分化的常用诱导因子及存在问题和展望进行综述，为相关研究的开展提供借鉴。

一、ESCs / iPSCs向雄性生殖细胞诱导分化常用的诱导因子

由于精子在体内形成遵循一定的规律，体外环境中，不同发育阶段的生殖细胞在不同诱导因子作用下可稳定地往下一阶段定向分化，为模拟精子在体内的形成过程，诱导ESCs / iPSCs向雄性生殖细胞方向分化的诱导因子种类及加入时间的选择应根据生殖细胞的体内发育特征而定，在诱导的不同阶段循序加入，一般可分为前期常用诱导因子、中期常用诱导因子和后期常用诱导因子。

（一）前期常用诱导因子

1. 骨形态发生蛋白（bone morphogenic protein，BMP）家族：BMP最初可用来诱导骨形成。近年来，随着研究的深入，科学家们发现BMP家族在胚胎发育和组织细胞分化中也起到重要作用，其中BMP4更是一种关键因子。BMP4属于转化生长因子-β家族的重要成员之一，在体内可影响睾丸的发育和生殖细胞的功能，是生殖细胞发育过程中的重要信号。在胚胎发育时期，BMP4作为分泌配体与丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，激活Smad信号通路，从而调控ESCs / iPSCs向PGCs的方向分化[9]。因此，在诱导ESCs / iPSCs向生殖细胞分化的起始阶段，BMP4是最为常用的关键因子[10]。

2009年，Ohinata等[11]将2只小鼠ESCs的BMP4和BMP8b基因分别敲除，导致二者外胚层细胞的PGCs特异性基因BLIMP1缺失，最终导致PGCs的缺失。同年，Kee等[12]将BMPs导入人的ESCs中，诱导分化14 d后，有5%的细胞表达生殖细胞特异性蛋白VASA，并且由实验观察到早期生殖细胞标志性基因DAZL，BLIMP1，STELLAR和VASA表达增加，其中，BLIMP1和STELLAR是PGCs的特异性基因，DAZL基因可促进PGCs的形成。2011年，Panula等[13]通过向培养基中添加BMP4、BMP7和BMP8b诱导因子，诱导人iPSCs向生精细胞方向分化，连续诱导7 d后，检测到4.85%的细胞表达生殖细胞特异性标志物VASA，并 且 有 5% 的 PGCs形 成。2015年，Sasaki等[14]使 用BMP4、SCF、EGF、LIF联合诱导人iPSCs向生精细胞分化，6 d后，有32%的细胞共表达生殖细胞早期特异性标志物EpCAM和INTEGRINα6，同时得到了人原始生殖细胞样细胞（primordial germ cells-like cells，PGCLCs）。以上研究表明，BMPs在诱导ESCs / iPSCs向雄性生殖细胞方向分化的前期阶段发挥关键作用，主要用于诱导得到PGCs。

2.白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、干细胞因子（stem cell factor，SCF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）：LIF是一种多效性细胞因子。PGCs膜表面存在LIF特异性受体LIF-R复合物，LIF通过与LIF-R特异性结合促进PGCs增殖。SCF是原癌基因c-kit编码的酪氨酸激酶受体c-kit的配体，SCF与c-kit相互作用有助于PGCs与体细胞的黏附及促进PGCs增殖。EGF是最早发现的生长因子，通过与细胞表面的表皮生长因子受体结合发挥促进细胞增殖的作用。这三种生长因子在诱导前期主要用于维持PGCs存活以及促进PGCs增殖。

2011年，Hayashi等[15]首先利用碱性成纤维生长因子和激活素A诱导小鼠ESCs，48 h后得到外胚层样细胞，之后使用 BMP4、LIF、SCF、EGF 诱导外胚层样细胞，4 ～ 6 d后得到PGCLCs。2016年，Wang等[16]用相同的方法诱导猪iPSCs向生殖细胞方向分化，仅4 d得到PGCLCs。2013年，Gafni等[17]在诱导人ESCs向生殖细胞方向分化过程中，首先将人ESCs诱导至原始状态，之后利用BMP4、LIF、SCF、EGF联合诱导，4 ～ 5 d后得到人PGCLCs。2015年，Sasaki等[14]诱导人iPSCs向雄性生殖细胞分化，在培养基中加入 BMP4、LIF、SCF、EGF，6 d后，检测到生殖细胞早期特异性标志物EpCAM和INTEGRINα6表达增加，并且得到人PGCLCs。以上研究表明，LIF、SCF、EGF在诱导ESCs / iPSCs向雄性生殖细胞方向分化的前期发挥重要作用，主要用于维持PGCs存活以及促进PGCs增殖，对稳定BMPs的诱导效果有重要作用。

综合上述实验结果可见，BMPs、LIF、SCF、EGF广泛用于诱导ESCs / iPSCs向雄性生殖细胞方向分化的前期阶段。BMPs主要用于诱导ESCs/iPSCs向PGCs方向分化，在诱导前期起着关键作用，LIF、SCF、EGF主要发挥维持PGCs存活、促进PGCs增殖以及稳固BMPs诱导效果的作用。因此，当以上4种因子联合作用时，可有效诱导得到PGCs。

（二）中期常用诱导因子

1.睾酮：精子发生是一个依赖激素的过程。男性生殖细胞的发育受下丘脑-垂体-性腺轴的调节与控制，睾酮是其中发挥调节作用的重要分子之一。睾酮是一种类固醇激素，在黄体生成素和促卵泡激素作用下由睾丸间质细胞合成和分泌，作用于支持细胞，促使支持细胞合成和分泌雄激素结合蛋白。睾酮与雄激素结合蛋白有很强的亲和力，结合后可促进生殖细胞的分化[18-19]。此外，有研究报道睾酮可通过刺激生精小管管周肌样细胞及支持细胞分泌神经胶质细胞来源的神经营养因子（glial cell-line derived neurotrophic factor，GDNF），从而促进SSCs的自我更新，进而保证精子发生的持续进行[20]。

2013年，Zanganeh等[21]将小鼠的SSCs与支持细胞共培养，加入睾酮、促卵泡激素及维生素后，诱导一周，得到精子细胞样细胞（spermatid-like cells，SLCs）。2016年，Zhou等[22]将小鼠PGCLCs与新生小鼠睾丸体细胞共培养，加入睾酮、促卵泡激素及牛垂体提取物，诱导10 d后得到单倍体的SLCs，14 d后，SLCs阳性率达到14%～ 20%，将获得的SLCs与野生型卵母细胞结合，得到具有生殖能力的健康后代。2017年，Deng等[23]在对照组中利用促卵泡激素、黄体生成素、GDNF等诱导羊SSCs，实验组在此基础上加入了睾酮，35 d后，对照组有5.54%的单倍体细胞产生，实验组的单倍体细胞产生效率提高到了9.18%。将得到的单倍体SLCs与卵母细胞结合，结合后的细胞可进一步发育。以上研究表明，睾酮对促进小鼠和羊的生殖细胞向精子方向进一步分化有不可缺少的作用，但目前尚未有研究报道睾酮对人生殖细胞进一步分化的调控作用。

2. GDNF：生殖细胞是由PGCs分化形成[24]，在雄性动物中，PGCs首先分化为SSCs，再由SSCs进一步分化成精子细胞。因此，维持SSCs的自我更新和分化是雄性生殖细胞发育过程中的重要一环。

GDNF是转化生长因子-β家族的一员，由支持细胞产生，通过与SSCs表面的受体复合物GFRα1结合，激活RET酪氨酸激酶发挥生物学效应。SSCs被认为是一种持续表达GFRα1的单个精原细胞[25]，近期有研究表明，在生精小管末端，GFRα1阳性表达的单个精原细胞是通过GDNF持续高表达得以选择性维持的[26]。因此，GDNF对维持和扩增SSCs有重要作用。2000年，Meng等[27]发现GDNF是调节小鼠SSCs自我更新和分化的重要因子，通过在培养小鼠SSCs的培养基里加入GDNF，发现高浓度GDNF促使未分化的SSCs大量增殖，低浓度GDNF促使SSCs向生精细胞方向分化。2011年，Kubota等[28]实验发现GDNF 同样可促进非啮齿类动物兔的SSCs自我更新和分化。2016年，Boozarpour等[29]首次指出，GDNF可诱导鸡间充质基质细胞向精原干细胞样细胞方向分化，并且推测GDNF有能力诱导鸡间充质干细胞分化成SSCs。同年，Chen等[30]通过实验发现Gdnf基因被敲除的小鼠其GDNF表达量比野生型小鼠降低40%，并且在敲除后，其SSCs严重缺失。以上研究表明，GDNF是促进SSCs在体内和体外自我更新和扩增的重要因子[31]。

综上所述，睾酮对推动生殖细胞进一步分化及促进精子发生有重要作用，GDNF可促进SSCs自我更新及增殖，从而保证精子发生的持续进行。

（三）后期常用诱导因子

维甲酸（retinoic acid，RA）是维生素A的衍生物，在细胞分化、胚胎发育、器官形成和生殖等方面起到重要作用。RA通过激活精子形成相关基因Stra8促进生殖细胞进入减数分裂[32]。有实验证明，小鼠睾丸支持细胞分泌的代谢酶Cyp26b1可降解RA，抑制RA信号，导致减数分裂被延迟。当性成熟时，Cyp26b1的表达量下降，RA信号重新启动，减数分裂开始。因此，RA是生殖细胞进入减数分裂与否的开关[33-35]。

2010年，Dong等[36]利用RA诱导胎牛生殖细胞向后期方向分化，48 h后继续用无RA的培养基培养5 ～ 7 d，得到细长型SLCs，将这些细胞注入胎牛卵母细胞中，有23.1%的卵母细胞成功受精并开始卵裂。2014年，Wang等[37]利用RA诱导鼠SSCs向单倍体细胞方向分化，2 d后，转为无RA培养基继续培养6 ～ 8 d，结果显示，减数分裂后特异性标志物Prm1表达增高，单倍体细胞相关基因Sycp3和TH2B表达增加。2016年，Wang等[38]利用RA诱导小鼠SSCs分化，仅24 h后，与SSCs分化及减数分裂相关的基因Stra8、c-Kit、SYCP3表达增高。2014年，Yang等[39]为帮助无精子症患者得到有功能的配子，利用RA和SCF诱导来源于隐睾患者的人SSCs向单倍体精子方向分化，结果显示，减数分裂特异性标志物SCP3、CREST、MLH1和单倍体细胞标志物Prm2、Acrosin的表达量均较对照组增高，并且得到了单倍体精子，将这些单倍体细胞与鼠卵母细胞结合，有60%成功受精并进一步发育。以上研究结果表明：在生殖细胞的发育过程中，RA对推动生殖细胞进入减数分裂并促进其向后期成熟方向分化起到非常关键的作用。此外，有研究表明在诱导ESCs / iPSCs向生殖细胞方向分化的过程中，生殖细胞的分化成熟程度对RA有浓度依赖性。2017年，Shah等[40]发现当加入的RA浓度为16 μmol/L时，与PGCs增殖及减数分裂相关的基因如DAZL、VASA、SYCP3等表达增高，当加入的RA浓度为2 μmol/L时，与生殖细胞成熟相关的基因如BOULE、TEKT1等表达增高，因此他们认为高浓度的RA（＞ 16 μmol/L）对于PGCs增殖及进入减数分裂有促进作用，而低浓度的RA（2 μmol/L）可促进后期生殖细胞的成熟。但是过高浓度的RA对细胞存在毒性，因此，在诱导分化过程中还需对RA的浓度以及培养基成分进行适当调整和把控。

二、存在的问题及展望

为研究男性不育的发病机制，一方面，可利用ESCs / iPSCs向生殖细胞分化为模型研究人类生殖细胞的发育规律，另一方面，在此基础上，可建立带有人类男性不育遗传背景的iPSCs，体外诱导其向雄性生殖细胞方向分化，以此为模型研究不育的发病机制。目前，在这一研究过程中还存在一些问题。（1）在重编程得到iPSCs的过程中，由于加入了外源性转录因子，因此得到的iPSCs可能携带新的遗传特征对后续进一步的诱导分化产生影响[41]。（2）目前，小鼠ESCs / iPSCs向生殖细胞分化的诱导体系已较为成熟，诱导得到的单倍体精子可与母鼠的卵细胞结合形成受精卵，并培育出具有生殖能力的健康后代。然而，人ESCs / iPSCs向生殖细胞诱导分化的研究进展则相对比较缓慢，诱导得到的多是较为早期的生殖细胞，分化较为成熟的生殖细胞仍然很难诱导获得。究其原因，是由于物种之间的差异，人和鼠的生殖细胞体内发育过程并非完全一致，一些在人PGCs阶段表达的基因，如作用于内胚层的SOX17、作用于滋养层的TEAD4等在鼠的PGCs阶段并不表达[42-43]，因此，诱导鼠ESCs / iPSCs向生殖细胞方向分化的方案并不完全适用于人的ESCs / iPSCs。（3）诱导效率比较低。在小鼠方面，例如，2013年，Li等[44]利用RA或睾酮诱导小鼠iPSCs向雄性生殖细胞方向分化，结果显示仅有2%～ 8%的单倍体细胞生成。2017年，Dong等[45]诱导小鼠ESCs向生殖细胞方向分化，利用SSCs培养基诱导时，得到的减数分裂后细胞只有1.36%，加入RA后，诱导效率有所提高，但也仅有17.2%，并且未得到更加成熟的生殖细胞。在人方面，例如，2011年，Eguizabal等[46]通过依次添加 FGF2、RA、hLIF、FRSK和R115866，诱导人iPSCs向生精细胞方向分化，9 ～ 10周后，检测到仅有0.4%～ 2.3%的单倍体配子生成。2012年，Easley等[47]利用添加了GDNF、FGF的培养基诱导人iPSCs向生精细胞方向分化，诱导10 d后，检测到仅有3.9%的单倍体配子生成。2014年，Lim等[48]利用BMP4和RA等三步法诱导人ESCs向生殖细胞分化，结果仅得到3%的单倍体生殖细胞。以上实验结果看出，利用目前的研究方案诱导得到单倍体配子的效率并不高。因此，体外诱导ESCs / iPSCs向雄性生殖细胞方向分化的诱导方案还需进一步优化。

如今，生殖健康受到越来越多的关注，男性不育成为影响生殖健康的一大问题。为研究其发病机制，同时避开伦理和技术等方面的限制，各研究小组利用携带男性不育遗传背景的iPSCs模型。在模拟精子体内发育过程的基础上，于体外诱导其向雄性生殖细胞方向分化，在诱导分化过程中，从细胞形态特征，基因表达水平，生物标志物等多个方面，将疾病来源的iPSCs与正常人来源的iPSCs进行对比，发现两者在发育过程中的差异，以此研究男性不育的发病机制。目前，新型基因编辑技术快速发展，尤其是CRISPR / Cas9技术被广泛应用，在研究男性不育的发病机制时，可利用基因编辑技术对疾病来源的iPSCs进行基因修正，将此细胞株与携带疾病遗传背景的iPSCs细胞株共同诱导分化，以此减少非致病因素的干扰，从而更精确地发现两者发育过程中的差异，进而更好地研究男性不育的发病机制，而得到基因修正的iPSCs作为疾病治疗的种子细胞用于临床研究。除此之外，由于在体外诱导ESCs / iPSCs向雄性生殖细胞方向分化的过程模拟了精子在体内的发育过程，因此，还可利用这一模型进行药物胚胎毒性检测及筛选。由此可见，ESCs / iPSCs的应用前景广阔，可诱导其向雄性生殖细胞方向分化，利用该模型研究男性不育发病机制、进行药物检测及用于疾病治疗，为维护和促进生殖健康奠定重要基础。