间充质干细胞旁分泌作用的研究进展

刘湄漪 陈乃耀

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）是一种多能干细胞，首次发现于成人骨髓中，曾命名为“MSCs、间充质基质细胞或多能基质细胞”[1]。国际细胞治疗学会根据其生物学特点制定了识别MSCs的最低标准，MSCs的特征为不表达 CD45、CD34、CD14或 CD11b、CD79α或 CD19、HLA-DR，并表达CD105、CD73和CD90的细胞，在体外可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞[2]。MSCs由于具有广泛的增殖能力、多系分化能力、免疫调节作用和旁分泌活性等特性，且易与多种组织分离，在组织工程和再生医学领域有着重要的应用前景。在组织损伤时，MSCs可通过直接植入目标组织或分化成熟组织起到组织修复功能。近年来的研究表明，MSCs除了具有多种分化能力外，可通过分泌生长因子、细胞因子和囊泡（如外泌体）来发挥其组织修复作用。这些分泌物统称为分泌体。MSCs释放大量生物活性因子（如细胞因子、趋化因子、生长因子和miRNAs等）。这些众多的旁分泌因子构成一个复杂网络的一部分，赋予细胞稳定性以及再生反应的放大[3]，对局部细胞动力学产生深远影响。因此，通过提供MSCs来促进旁分泌因子的生成，或直接给予MSCs的旁分泌因子，都构成未来MSCs治疗的基础。

一、MSCs分泌功能

研究表明，成人MSCs的治疗作用有80%以上是通过这种旁分泌介导来实现的。MSCs分泌的蛋白质具有抗微生物、抗纤维化和促再生的作用，对细胞增殖、分化、免疫调节、血管生成、创伤愈合及组织再生等过程都有作用[2,4]。MSCs分泌的各种因子被称为分泌体，由多种细胞因子、趋化因子、血管生成因子和生长因子等组成[5]。该分泌体可影响局部微环境中其他细胞的活动和功能。MSCs产生的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1和胸腺肽B4等因子，对缺血心肌细胞具有一定的细胞保护作用[6]。此外，肝细胞生长因子、VEGF、基质细胞衍生因子-1、 角质化细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板生长因子、单核细胞趋化因子-1和胰岛素样生长因子-1等生长因子与细胞增殖和再生作用有关[7]。MSCs可通过增加抗炎因子[白细胞介素（interleukin，IL）-10、肿瘤坏死因子诱导蛋白6]和减少促炎症因子（IL-1a、IL-6、IL-17、IFN-g、GCSF、GMCSF、MIP-2a、MCP- 1）而表现抗炎作用[8]。MSCs还能分泌VEGF-A和Ang1/Ang2，促进血管生成，其中，Ang 1/ Ang 2在新生血管的成熟过程中起作用，这些因素共同促进了伤口的愈合[8]。在急性肾损伤中，MSCs的保护作用是由于IL-10、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-α和B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）等抗炎和器官保护介质的调节增强[9]。Tgel等[10]报道了在急性肾损伤模型中注射MSCs细胞治疗，证实了促肾素-肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子的产生可以减少细胞凋亡，刺激肾上皮细胞的增殖，主要反映了MSCs的旁分泌功能。此外，在免疫应答过程中，MSCs释放的许多可溶性因子作用于免疫细胞，通过修复受损细胞或抑制免疫活性发挥作用。MSCs的免疫调节活性需要抗原呈递细胞和T细胞分泌的炎性细胞因子，包括 IFN-γ，IL-1α，IL-1β 和 TNF-α，这些炎性细胞因子可激活MSCs分泌吲哚胺2,3-双加氧酶，肿瘤坏死因子诱导蛋白6，一氧化氮，IL-10，CCL2，半乳糖凝集素，前列腺素E2和转化生长因子 -β（transforming growth factor-β，TGF-β）等免疫抑制因子，从而调节组织稳态[11]。

二、MSCs来源的外泌体

MSCs除了分泌一系列的可溶性因子外，还可释放大量的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVS），其内容物被称为“货物分子”，通过质谱、下一代测序和脂质谱分析，可以推断出它们的潜在功能[12-13]。EVS通常分为2个主要的亚群体，即外泌体和微囊泡。外泌体较小，大小为40 ～ 120 nm，起源于腔内小室，多囊体内囊泡通过胞吐而释放。微囊泡较大，约200 ～ 1 000 nm，直接从质膜萌发。新出现的证据表明，EVS货物分子由具有不同生物学性质的分子组成，包括脂类（即胆固醇、鞘磷脂和己糖基）、蛋白质（内吞体相关蛋白、四超蛋白和脂质Raft关联蛋白以及离散蛋白负荷）、RNA亚型（即mRNA、miRNA、tRNA、rRNA、siRNA、lncRNA）和DNA亚型（即 mtDNA、ssDNA、dsDNA）[14-16]。MSCs-EVS免疫原性低，循环半衰期长，能穿越脑血屏障（BBB）；具有再生反应媒介的潜在作用。含有脂质、蛋白质、RNA和DNA的EVS在生理和病理生理通讯过程中介导靶向细胞间信号传递[17-18]。EVS介导细胞与细胞通讯的机制包括：（1）通过信号复合物的作用刺激受体细胞；（2）将表面受体或脂类转移到受体细胞；（3）通过胞内途径传递细胞质蛋白和核酸；（4）通过膜融合传递细胞质蛋白和核酸。

Raposo等[19]在1996年B淋巴母细胞的研究中，通过免疫电镜证实含有主要组织相容复合物Ⅱ类分子（major histocompatibility complex classⅡ，MHCⅡ）的内膜囊泡可以转移至质膜，并直接与质膜融合，从而释放MHCⅡ类分子，首次提供了关于EVS作为免疫生物学过程中信号传递媒介的第一个实验证据。此后的研究发现EVS介导了各种免疫细胞类型之间以及肿瘤与免疫细胞之间的相互作用[20]。EVS具有将细胞内的货物分子转移到靶细胞并诱导表型和行为改变的能力。此外，它们还能保护细胞质成分免受化学物质和酶的破坏或降解[21-22]。研究表明，MSCs来源的EVS与MSCs本身具有相似的治疗活性。在大鼠急性肾损伤[23]以及缺血性心肌病[24]中发现MSCs来源的EVS具有抑制促炎症过程，减少氧化应激和纤维化的作用。此外，MSCs-EVS还具有抗凋亡、促进血管生成、促进神经元存活和分化等功能[25-26]。尽管目前的研究认为MSCs-EVS抑制氧化应激，促进血管生成，对组织特异性干细胞产生积极影响。但抑制促炎症反应仍是影响组织修复的最重要因素。在缺血性脑卒中模型中发现神经祖细胞不能有效地产生成熟的神经细胞[27]，其原因与内源性干细胞和祖细胞在炎症环境下启动再生过程受限有关。内源性干细胞和祖细胞需要一个耐受性的环境来生存和促进再生。在细胞水平上， MSCs-EVS能够将巨噬细胞M1转化为M2，M2巨噬细胞释放的EVS能够促进调节性T细胞的形成，增加IL-10和TGF-β等抑制性细胞因子产生，从而起到抗炎作用[28]。因此，通过将促炎症转化为耐受性环境，MSCs-EVS促进再生过程。总之，多项研究表明EVS至少可以部分再现MSCs治疗所获得的生物学效应，MSCs-EVS的临床应用具有潜在的研究价值。

三、调控旁分泌因子发生和释放的机制

近年来如何调节旁分泌因子的产生和释放被越来越多的人关注。这包括2个方面：（1）什么样的信息调节细胞旁分泌因子的表达；（2）控制蛋白质或外泌体从细胞中释放的机制。细胞信息传递和交换的方法之一是通过分泌这些因子（可溶性蛋白、外泌体和微囊泡），进而诱导受体细胞表型和功能的改变。在传统的分泌途径中，蛋白质在高尔基体中分类，被运送到质膜，并通过与质膜的融合而释放[29]。

早期研究表明，根据外界环境的刺激，MSCs以不同的方式释放EVS，这一过程是通过MSCs与周围微环境的相互作用来调节的。有研究证明，MSCs在缺氧或炎性条件作用下可调节EVS中货物分子的成分，并影响其功能特性[30-31]。一些与MSCs所处的微环境相关途径已经被报道可调节EVS的生物发生和分泌。例如，肿瘤抑制物激活途径6可调节EVS的形成，并受p53的转录调控，从而促进EVS的产生[32]。控制外泌体货物分子的生物发生和组成的机制尚不清楚。一种可能的分子机制是通过运输所需的内体分选复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT），它在泛素化蛋白与外泌体的结合和分类中起着重要的作用[29]。细胞内源性蛋白质Alix已被证明参与了细胞内膜转运和细胞骨架重塑[33]。研究报告表明，外泌体的生物发生是由连接Syndecans和Alix的syntenin控制的，这些组件蛋白刺激内体膜出芽[34]。Alix与ESCRT的相互作用主要与外泌体胞内负荷的积累有关。

参与外泌体释放的结构包括细胞骨架（肌动蛋白和微管）、分子马达（驱动蛋白和肌球蛋白）、小GTPase和N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNAREs）[14]。外泌体是由p53调控的细胞胞吐作用释放的，其生物发生依赖于细胞骨架的激活[35]。现在具有挑战性的研究是确定外泌体中包含哪些特定的生物活性因子，并阐明这种外泌体释放和转移的重要机制，实现EVS货物分子的可操纵性，使其生物活性因子可特定和有效的交付给选定的目标细胞。

四、MSCs来源对旁分泌活性的影响

利用MSCs旁分泌活性进行治疗的最关键因素是细胞本身的质量和效力。由于不同组织来源的MSCs相似性和差异，它们对不同治疗应用的适用性是一个不断争论的话题。研究表明，来自不同组织来源的MSCs具有不同的分泌谱和不同的外泌体组合物[36]。

经过分析了各种MSCs群体的分泌蛋白组，发现通常MSCs分泌体是包含ECM成分、免疫调节因子以及多种生长因子和细胞因子的混合物。不同组织来源的MSCs特异性比较研究证实，MSCs的旁分泌活性取决于细胞的起源。一项研究比较了骨髓（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BM）、脂 肪（adipose tissue-derived stromal cells，AD）和Wharton's Jelly来源的MSCs，发现Wharton's Jelly来源的MSCs分泌免疫调节因子最多，如IL-6、IL-7和IL-10以及血小板源生长因子-AA和TGF-β2，而AD-MSCs产生的ECM蛋白和酶更多，如胶原蛋白-1和-2和基质金属蛋白酶[37]。有研究发现在BM，AD和脐带来源的MSCs群体中神经调节因子的产生方面存在差异，BM旁分泌因子是减少氧化应激最有利的治疗来源，而AD和脐带旁分泌因子则对抗兴奋性毒性的保护作用更有利；此外，BM和hUM的分泌体作为抗凋亡制剂更具优势[36]。

胎儿与成人来源的MSCs在治疗潜力上存在差异。胎儿MSCs所产生的因子本身既可以作为治疗药物，也可以作为旁分泌调节剂。在大鼠牵张成骨模型中，胚胎MSCs释放的因子能够减少MSCs的复制衰老，并比成人MSCs分泌体具有更强的促成骨作用[38]。MSCs的年龄和组织来源都提供了独特的细胞表达，包括抑制性Kappa B激酶（IκB）、丝裂原活化蛋白激酶、核因子Kappa B（NFκB）、CD151、溶酶体膜蛋白1和溶酶体膜蛋白2的差异表达[39-41]。虽然对MSCs的年龄和来源变化的了解越来越多，但对影响该MSCs分泌体的因素了解有限。最近的研究表明随着年龄的增加，MSCs外泌体的功能有所改变。最近的一项研究表明，MSCs外泌体表达功能性呼吸复合物Ⅰ、Ⅳ和Ⅴ，这种复合物在受损的细胞中可消耗氧气，并促进有氧ATP合成。然而，比较从≥37周龄新生儿（即足月儿）和28 ～ 30周龄新生儿（即早产儿）的脐带MSCs培养物中分离出的外泌体，其ATP合成仅在足月新生儿的外泌体中检测到，这提示了一种胎龄早期未完成的特定机制[42]。因此，这些发现提示MSCs外泌体产生包含另一层基于细胞年龄相关的复杂性差异。此外，MSCs的分化状态对其旁分泌活性也有影响，在向成骨、软骨和脂肪细胞分化过程中，MSCs分泌的蛋白质组成发生了变化，这些变化中大多反映了这些细胞功能的变化。例如，Arufe等[43]表明，脐带间质来源MSCs分泌的蛋白质在进行软骨形成分化时发生了变化，在鉴定的342种不同蛋白中，17%是与软骨形成相关的因子（例如MMP和ECM蛋白）。

目前，MSCs的旁分泌成分及其作用已成为组织再生研究的热点，探讨和发现调节细胞存活、增殖、分化或炎症反应的分泌体，对于组织修复具有重要意义。由于提取和收集相对困难，限制了对分泌体功能研究和分析。深入研究分泌体的产生和释放机制，进一步优化对MSCs的预处理方案和分泌体提取流程，将为获得特定的分泌体提供机会。同时，加强分泌体作用的分子机制研究，探讨MSCs旁分泌作用的治疗潜力，将为许多疾病的干预提供了的新途径。目前利用MSCs分泌的各种因子替代传统的细胞疗法，还需要更多的实验研究及临床实践的论证。