间充质干细胞治疗糖尿病皮肤损伤的研究进展

张涛 惠定一 王颜刚

一、糖尿病皮肤损伤的发病特点

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一组代谢紊乱综合征，以高血糖为主要临床表现[1]。随着病程进展，糖尿病可出现一系列并发症。糖尿病患者皮肤易受内源性及外源性的各种损伤，尤以合并酮症酸中毒等急性应激情况下更易受损，且损伤后创面迁延难愈，同时易继发感染等，病变严重或处理不当常可致残、致死，严重影响患者的疾病预后及生活质量。约30%糖尿病患者在病程中可出现或伴发各种皮肤损伤，其发病机理较为复杂，迄今尚无明确统一的结论，目前的总体研究提示，糖尿病皮肤损伤并非单因素的病理过程，血糖的慢性升高及代谢紊乱只是典型的特征之一[2-4]。

二、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）概述

MSCs是一类来源于中胚层和神经外胚层的成体多能干细胞。由Friedenstein等[5]于20世纪70年代年从骨髓中首先发现。传统理论认为这群细胞在特定诱导条件下可向中胚层细胞即骨、软骨和脂肪细胞分化，然而越来越多的研究发现MSCs具有向内、中、外三个胚层包括干细胞、心肌细胞、肌健、韧带和骨髓基质等分化发育的潜能[6]。研究发现，从骨髓、脐带血等多种组织中均可以提取并分离出MSCs，目前应用研究较多的是骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）和人脐带间充质 干 细 胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）[7]。hUCMSCs有很强的“可塑性”，即能够定向分化成机体内的各种功能细胞、组织和器官。其增殖能力强，分化潜能大，免疫原性低，同时取材相对方便，也容易制备，而且没有道德伦理问题的限制，由于存在以上诸多优点，故临床上有望成为最具前景的多能干细胞，成为近年来医学界的研究热点[8]。

三、MSCs治疗糖尿病皮肤损伤研究现况

目前针对糖尿病皮肤损伤的传统治疗，主要包括控制血糖、血压、血脂、体重，戒烟，适当予以减轻水肿、控制感染、营养神经、改善循环等措施，必要时予以清创、介入及截肢等措施，对于全身状况较差、病变较严重者，往往疗效不能令人满意[9]。

MSCs治疗糖尿病是一项近年新兴且有广泛应用前景的新技术，将MSCs应用于治疗皮肤创伤的尝试始于本世纪初。有研究发现，MSCs有直接分化为血管细胞和相关支持细胞的能力，进而可以促进皮损的修复[10]。糖尿病慢性创口往往缺乏血供，局部供氧较差，值得一提的是，即使在缺氧的条件下，MSCs亦可迅速发起动员，分泌多种生长因子以促进组织生长和局部血管生成[11]。

Kuo等[12]应用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导出40只雄性Wistar糖尿病大鼠，并建立背部皮肤缺损（6 cm×5 cm）模型，将其分为4组：Ⅰ组，非糖尿病大鼠（对照组）；Ⅱ组，不应用间充质干细胞的糖尿病对照组；第Ⅲ组，第7天每只接受一定MSCs的大鼠（在伤口边缘周围的8个区域皮下施用）；第Ⅳ组，第7天和第10天个接受上述治疗量MSCs的大鼠。结果发现，同一时间内，MSCs治疗大鼠的伤口面积减少。与对照组相比，MSCs治疗1次的大鼠的伤口愈合时间缩短，而MSCs治疗2次的大鼠伤口愈合时间缩短更明显。与对照组相比，组织学分析显示MSCs治疗组局部炎症反应减少；免疫组化分析显示MSCs治疗组相关生长因子如表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、脯氨酰4-羟化酶和增殖细胞核抗原Ki-67的表达增加。该研究得出的结论是，MSCs能够缩短糖尿病伤口愈合时间，并且这与它们改变局部组织的微环境及改变某些生物标志物的表达有关。

Inoue等[13]通过研究，并应用体内发光成像（Bioimage）等技术，证实了BMSCs参与创伤修复与愈合的整个过程。该研究用STZ处理大鼠诱导糖尿病模型，在其头部手术制成全层皮肤缺损，用BMMSCs浸渍的人造真皮覆盖，使用免疫组织化等方法评估伤口愈合，并使用Bioimage技术确定移植的MSCs状态。用MSCs浸渍的人造真皮处理的糖尿病鼠伤口小于术后1周单独用人工真皮处理的糖尿病伤口。在愈合（3周）期间，在移植部位检测到MSCs的光子，而仅在植入后1周，MSCs的细胞被耗尽。用MSCs处理的愈合部位的免疫组化显示CD31+血管随着VEGF的表达而增加，表明MSCs促进血管生成。这些发现表明，在糖尿病大鼠模型的愈合过程中，移植的MSCs可以保留在伤口部位，促进伤口愈合。

Khosravi等[14]应用腹膜内注射STZ诱导成26只雄性Sprague-Dawley糖尿病大鼠模型，随机分为2组，6周后，在每只大鼠的背部产生全层圆形切除伤口。将来自雄性大鼠腹部脂肪组织的脂肪间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cell，AD-MSCs）溶于适量磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并在治疗组皮肤周围进行注射治疗。PBS用于对照组和非DM组。每隔1天测量伤口面积。伤口愈合完成后，从伤口部位采集全层皮肤样本，用胶原纤维的体积密度，血管的长度和体积密度以及成体细胞的数值密度进行立体观察。结果：AD-MSCs注射加速了糖尿病大鼠的伤口愈合速度，但不增加血管的长度和体积密度以及胶原纤维的体积密度。该实验给出的结论：局部皮下注射AD-MSCs可以加快糖尿病大鼠的皮肤伤口愈合速度，但不是通过增加血管长度或密度，也不是通过积聚胶原纤维来实现的，具体机制尚未进行进一步研究。

Tark等[15]建立糖尿病模型小鼠，针对延迟愈合的创伤皮肤组织，分别应用hUCMSCs局部皮肤注射和尾静脉注射两种方法加以干预，发现上述两种方法对伤口的愈合的促进均起到积极作用，差别无统计学意义；后通过检测细胞因子发现，注射hUCMSCs后，皮损组织中VEGF及转化生长因子 -β（transforming growth factor-β，TGF-β）含量增多，故推想MSCs促进创伤愈合的原因可能是局部组织某些生长因子的增多促进了细胞增殖、组织再生，从而提高了创口的愈合的速度。

Kim等[16]将60只裸鼠随机分配到Ia组（糖尿病对照组，n= 20），Ib组（糖尿病实验组，n= 20）和Ⅱ组（非糖尿病对照组，n= 20），在缺血性肢体产生后，Ib组局部注射AD- MSCs后3天、7天和25天后分别进行组织学观察和相关因子检测。结果发现：Ia组动物容易出现坏疽形成，导致较低的存活率。Ib组动物早期具有丰富的新生血管形成和更好的组织重塑，存活率高。Ib组血浆和组织VEGF水平高于Ia组，与Ⅱ组相当。这项研究证实了AD-MSCs对糖尿病裸鼠缺血性创伤愈合的有益效果，推想其可以通过旁分泌VEGF的方式促进创口周围组织新生血管的形成，进而改善了糖尿病微血管损伤引起的微环境的缺氧状态，促进了细胞增殖，进而促进了糖尿病患者皮肤组织缺损的愈合。

糖尿病足是糖尿病较为严重的并发症之一，是因糖尿病血管病变和神经病变等因素，导致糖尿病患者足部皮肤、皮下组织及肌肉组织等破坏（包括溃疡、感染、组织坏死等）的一种病变[17-18]。糖尿病足通过常规的保守治疗常常难以达到令人满意的效果。

在国内，王广宇等[19]选取32例糖尿病足病患者，将hUCMSCs稀释后行双下肢肌肉内注射，一段时间后评价其下肢缺血和周围神经病变的情况。结果显示移植后6个月疼痛评分及冷感评分明显改善，腓浅神经、胫神经感觉神经及运动神经传导速度增快，上述实验说明hUCMSCs可以改善糖尿病下肢缺血性病变及周围神经病变的临床症状及某些客观指标。

Yu等[20]将 hUCMSCs制作成悬液 [细胞数（1 ～ 6）×1011个/L]，针对11例糖尿病足患者，给予多点（每点0.3 ～ 0.5 ml）肌肉注射到患侧下肢的治疗措施，通过后续的观察发现，这些患者主观的不适（如疼痛、麻木感及冷感等）较前明显缓解，足部坏疽或溃疡的创面有不同程度的缩小，有的甚至可以达到基本愈合的程度，这说明hUCMSCs的移植可能是一种简单，安全和有效的治疗方法，可有效增加下肢血流量，促进溃疡愈合，降低截肢率和截肢水平。此研究为糖尿病患者下肢缺血性病变的治疗提供了新的思路。

四、MSCs治疗糖尿病皮肤损伤方面的可能机制

（一）MSCs的分化及归巢作用

MSCs具有强大的多能性，可以分化形成皮肤结构，如上皮细胞、基质细胞和肌肉等附属结构，参与组织的再生与创面的修复，同时MSCs可以归巢到损伤部位，在其中分化成相应的组织细胞，进而改善高血糖造成的各种损伤[21-22]。

（二）MSCs分泌生物活性物质修复受损皮肤组织

最近研究表明：MSCs能在损伤部位分泌可溶性因子[23-24]，如肝细胞生长因子，白细胞介素-6，TGF-β，VEGF，血小板衍生生长因子等，改变组织血管微环境，提高损伤组织的再生能力，刺激上皮样祖细胞的增殖、分化，减轻炎症和免疫反应，且这种作用已超过了其定向分化能力。MSCs分泌生物活性物质的机制尚不完全明了，且多种细胞因子相互作用的机制仍进一步探究。

（三）MSCs促进新生血管的生成

血管内皮细胞是干细胞微环境的重要组成部分，研究表明MSCs可分化为血管内皮细胞，表达其特异性的受体，通过自分泌促进新生血管形成，改善相关并发症症状；此外MSCs能够合成和分泌EGF、VEGF、TGF-β等多种因子，这些活性因子通过旁分泌作用促进血管新生[25]。VEGF是一种特异性内皮细胞有丝分裂原，能促进血管内皮细胞有丝分裂形成新生血管。EGF能动员骨髓内皮祖细胞促进新生血管形成。

（四）MSCs的免疫抑制作用

MSCs具有免疫调节作用。有研究表明，MSCs受到相关炎症因子的刺激后，即可表现出很强的免疫抑制作用。免疫激活的T细胞释放TNF-α及IL-1等细胞因子，刺激MSCs产生较多趋化因子和一氧化氮；前者招募T细胞向MSCs聚集，而后者抑制T细胞的增殖，产生免疫抑制效果[23]。

以上主要回顾了糖尿病皮肤损伤的特点，MSCs的生物学特性及其治疗糖尿病皮肤损伤的进展。虽然糖尿病皮肤损伤的发病机制极为复杂，治疗上仍比较局限，但已经有多个实验研究证实，MSCs在此方面的治疗效果是可观的，虽然这些研究对象多数为动物（鼠类），而且目前MSCs在临床应用上仍然存在响应率和安全性等问题，但相信随着MSCs作用机制研究和临床研究的不断推进，上述问题一定会逐步改善，MSCs在临床治疗上的前景将是非常广阔，这必将给临床带来巨大福音，令人期待。