浅谈细菌素Nisin

□ 张雪颖 苏州大学剑桥-苏大基因组资源中心

Nisin 是由乳酸乳球菌产生的I类细菌素，由于它能有效地抑制或灭活腐败菌和食源性病原菌而被广泛应用于食品中。本文对Nisin 灭菌机制、调控及分离纯化进行简单介绍。

Nisin是已知的最古老和最具特征的硫醚抗生素，于1928首次被发现，并于1969批准用于食品工业。由于它能有效地抑制或灭活腐败菌和食源性病原菌，已有50多个国家被许可用作食品防腐剂。Nisin 由乳酸链球菌产出，是一种具有正电荷的34个氨基酸肽，其线状结构由五个内环和一个灵活的中枢区域组成。

Nisin的渗透细胞膜的机理是通过两种不同的途径实现的。一种理论是通过孔隙形成机制。Nisin通过结合一种细菌细胞被生物合成所必需的细胞膜前体，即脂类II，来连接细菌细胞 质 膜（Cytoplasma Membrane，CM）。当几个Nisin分子聚集在一起时，就会在CM中形成孔隙。第二种理论是低亲和力渗透机理。与负电荷的细菌磷脂结合后，Nisin进入磷脂的亲水基之间，多个Nisin单体聚集在外层的脂质单层中，形成一个短寿命的类孔结构，使它能够跨越脂质双层。这两种机制均能改变CM的形成，抑制靶细胞细胞壁的合成，从而抑制细胞的生长。一些革兰氏阳性菌，如乳球菌、乳杆菌、皮球菌、微球菌、葡萄球菌和李斯特菌都对Nisin敏感。此外，Nisin也可以防止或抑制芽孢杆菌和梭菌的内孢子生长和营养生长。由于革兰氏阴性菌外模的渗透屏障，使得Nisin对革兰氏阴性菌没有抗性。

靶细胞的一些因素，如细胞磷脂含量低、膜脂肪酸组成改变、细胞壁组成变化等，能够影响Nisin的活性。此外，结合在细胞壁上的负电荷多糖可提高靶细胞对Nisin的抗性。

Nisin生物合成的调控

11个基因组成的基因簇，即nisABTCIPRKFEG，参与了Nisin的生物合成。基因nisA编码nisin A前体肽；基因nisB和nisC参与翻译后修饰反应；基因nisT参与前体nisin的易位；基因nisP参与前体加工；基因nisI和nisFEG分别参与nisin的自我保护和免疫；基因nisR和nisK参与了nisin生物合成的调控。

Nisin本身作为信号分子生物，合成受群体感应调控。在nisin生物合成的自调控过程中，两组调控系统，即nisK和nisR，在nisin的转录激活和下游生产中起着重要的作用。作为一种传感器组氨酸激酶，NisK能感觉到nisin和自磷酸化酸盐的存在。磷酸化后，磷酸盐基转移到反应调节剂NisR中，诱导nisA和nisF启动子的激活，从而合成未经修饰的前体nisin。未经修饰的前体nisin由假定的酶NisB和NisC修饰，然后通过ABC转运体NisT跨膜转运。通过NisP对前体nisin进行修饰后，nisin被激活并释放。此外，NisIFEG还共同作用以防止nisin的杀菌作用对自身细胞的破坏，从而确保对宿主细胞的免疫力。

Nisin的分离纯化

从食物和食品中分离Nisin的方法包含筛选乳酸菌的抗菌活性，并将得到的抗菌物质进一步分离和确定，以便确定为细菌素。一般采用软琼脂（0.75%）覆盖法分离细菌素。为了排除过氧化氢产生抑制的可能性，在培养基中加入过氧化氢酶；在固体琼脂中加入碳酸盐或磷酸盐缓冲液，以避免有机酸的拮抗作用。噬菌体所造成的抑制作用也可以通过排除在带有敏感指标的琼脂上缺乏噬菌体菌斑而确定。这种抑制活性是通过spot-onlawn方法或在带有敏感指示物的琼脂平板上进行扩散试验来检测和证实的。

Nisin是在培养基中分泌的蛋白质类化合物。在纯化前，nisin需要从产生的培养物的无细胞上清液中浓缩。通常，采用硫酸铵沉淀蛋白质和用丁醇、乙醇等有机醇提取蛋白质的方法来选择性地提取nisin。然后，通过阳离子交换、凝胶过滤、疏水作用和反相液相色谱等几个色谱步骤纯化细菌素。纯化细菌素的产量往往很低，可能是由于提纯步骤过多导致的。因此，优化细菌素的产生是实现细菌素浓度最大化的重要步骤。

含nisin的食品生物保存

Nisin由乳酸菌（L.lactis）产生，是唯一获准用于某些加工奶酪、乳制品和罐头食品中的食品防腐剂的细菌素。在食品中添加nisin可以通过减少化学防腐剂的使用和/或热处理强度来提高加工产品的感官和营养特性。大多数情况下，乳酸菌细菌素与传统和新的保存方法（例如高压处理和脉冲电场）共同作用，以灭活目标腐败菌或致病菌。这些组合之所以有效，是因为细菌细胞受到更严重的损害，在联合治疗后可能需要更多的能量来修复损伤，导致能量耗尽和细胞死亡。因此，食物的卫生质量得到改善，保质期得到延长。