UPLC-MS法测定减肥茶中的咖啡因

□ 李泽夏琼 贵州省食品药品检验所 石春梅 贵州医科大学神奇民族医药学院

现如今，随着人们的生活水平不断提高，肥胖症成为一种普遍的慢性健康疾病，一直威胁着全球人类的健康。随着科学家对于肥胖症的机理及减肥药药物的不断研究[1]，各种不同原理、不同形态、不同使用方法的减肥类保健食品也相继登上了市场，在这其中，减肥茶由于其明显的效果、方便的使用方法以及独特的口感，成绿色健康减肥的主潮流中的宠儿[2]。市面上的减肥茶的主要成分包括：茶叶、荷叶、番泻叶、决明子、绞股蓝等[3]。

咖啡因是茶叶中主要功效成分之一，能够通过加快脂肪的氧化、提高能量的消耗速度并且有适当降低食欲的效果。然而，长期大量服用咖啡因不仅会对容易对敏感的消费者产生失眠、兴奋、耳鸣、躁动不安等不良作用[4]，对于一般消费者也有许多不良影响，严重的甚至可以导致肌肉震颇和心跳过速[5]。有研究表明过量摄入咖啡因会对妊娠妇女产生多种不良影响，造成胎儿宫内发育迟缓、早产、先天畸形等[6]。因此，根据加拿大卫生部发布建议，健康成人每天咖啡因的安全摄入量仅为400 mg，未成年人和孕妇的安全摄入量更小[7]。

国家食品药品监管局药品检验补充检验方法和检验项目批准件（2006004、2012005）以及《食药监办许[2010]114号及附件中将咖啡因作为减肥类保健食品中的非法添加物质，但对于减肥茶中的咖啡因含量未进行检验和规定。因此，建立超高效液相-质谱联用仪测定咖啡因含量可以为减肥茶的质量控制提供依据，并对其安全性和有效性进行了保证。本文建立了减肥茶中咖啡因含量测定的超高效液相-质谱联用仪法，进行方法学研究，对碧生源减肥茶中咖啡因含量进行测定，此法的前处理简便、检测快捷省时，稳定性与准确性、专属性、线性关系都较良好，能准确、快速检测减肥茶中咖啡因含量，对确保减肥茶中咖啡因的含量安全性具有重要意义，也对今后针对减肥茶进行的各类研究提供了实验数据和理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters超高效液相质谱联用仪（XEVO-TQ）、超声波清洗器（KQ-500DE,昆山市超声仪器有限公司）、电子天平（XS105DU，MS105DU，德国METTLER TOLEDO公司）。

1.2 试剂试药

95%乙醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）、甲醇（分析纯：天津市富宇精细化工有限公司；色谱纯：美国Tedia公司）、水（去离子水，实验室自制）。

1.3 对照品与样品

咖啡因对照品（中国食品药品检定研究院提供，含量100%，批号：171215-201010）；碧生源常青茶（原碧生源牌减肥茶），来源于北京澳特舒尔保健品开发有限公司，批号：04161204），每100 g含茶多酚1.33 g、总黄酮0.42 g。

2 方法 [4-6]

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取0.010 01 g咖啡因对照品，置于10 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声数分钟使溶解，放冷，用甲醇定容至刻度，该溶液中咖啡因的浓度为1.001 0 μg/mL；再精密吸取上述溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，该溶液中咖啡因的浓度为0.010 01 μg/mL。

2.1.2 供试品溶液的制备

取碧生源减肥茶三包，置于研钵中，混匀，研细，精密称取细粉0.1 g,至50 mL 量瓶中，加适量乙醇，超声35 min，待冷却至室温，加乙醇定容至刻度线，用力振摇提取。用微孔滤膜（0.22μm）过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2 色谱条件及质谱条件

2.2.1 色谱条件

色 谱 柱： ACQUITY UPLC BEH C18（美国Waters 公司，1.7 μm，2.1×100 mm，柱号02573512515702）。流动相：甲醇-水（20∶80）。流速0.2 mL/min；柱温30 ℃。分别精密吸取2.1项下的3种溶液各0.1 μL注入UPLC-MS，在上述色谱条件下进行分析，记录色谱峰，考察系统适应性。

2.2.2 质谱条件

以195.196为母离子，110.038和137.965为子离子，锥孔电压为32 V，子离子110.038碰撞能量为24 V，子离子137.9645碰撞能量为18 V。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系实验

精密称取咖啡因对照品0.010 03 g置于10 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取5 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即配制得浓度为0.100 3 μg/mL对照品溶液。在上述设定好的色谱条件下，精密量取对照品标准溶液1、2、3、4、5、6 mL于25 mL容量瓶中，分别用甲醇定容至刻度，摇匀，即得线性溶液。将其分别注入UPLCMS中，进样量0.1 μL，记录色谱图，以峰面积A为纵坐标，咖啡因的量c（μg）为横坐标，绘制线性回归曲线，计算线性方程及相关系数r。

2.3.2 仪器精密度试验

精密吸取同一浓度（0.012 036 μg/mL）对照品溶液0.1 μL，在上述设定好的色谱条件下重复进样6次，记录咖啡因对照品图谱峰面积，计算6次峰面积值的RSD。

2.3.3 重复性试验

按照2.1.2项下方法，分别处理6份供试品溶液，分别进样0.1 μL，测定峰面积，计算样品中咖啡因的含量，并计算含量平均值。

2.3.4 稳定性试验

取重复性试验中的第1份供试品溶液，在上述色谱条件下分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样，测定样品中咖啡因峰面积，计算6次峰面积值的RSD。

2.3.5 回收率试验

进行加样回收试验。精密称取咖啡因对照品0.010 03 g置于10 mL容量瓶，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取5 mL置于50 mL容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即配制得浓度为0.100 3 mg/mL对照品溶液。取减肥茶适量，置于研钵中，混匀，研细，精密称取细粉9份各0.05 g，分别置50 mL量瓶中，其中，第1、2、3份分别精密加入咖啡因回收率对照品溶液1 mL，第4、5、6份分别精密加入咖啡因回收率对照品溶液3 mL、第7、8、9份分别精密加入咖啡因回收率对照品溶液5 mL，9份试样分别用乙醇定容至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔膜滤过，置进样瓶中，分别注入UPLC-MS进行含量测定，计算咖啡因回收率。

3 结果

3.1 系统适应性

在2.2项所述色谱以及质谱条件下，咖啡因出峰时间适宜，峰型对称，效应值高，并无其他碎片离子干扰。咖啡因对照品如图1所示。根据灵敏度选择137.965作为定量离子，110.038作为定性离子。离子分图（定量离子及定性离子如图2、图3所示）。

图1 咖啡因对照品（总离子图）

图2 咖啡因定量离子

图3 咖啡因定性离子

表1 回收率试验结果

表2 样品含量测定结果

3.2 线性关系结果

通过绘制标准曲线，得线性回归方程式为y=25166059x-15186，r=0.99986，其咖啡因在0.000 401 2μg～0.002 407 2 μg内范围内呈现良好线性关系。

3.3 仪器精密度结果

计算咖啡因对照品平均峰面积为304 648，以及峰面积RSD=0.95%（n=6），表明此方法精密度良好。

3.4 重复性结果

结果样品含量6次测定值在6.21～6.26 mg/g范围内，样品平均峰面积为304 280，计算RSD结果为0.96%。结果表明样品重复性良好。

3.5 稳定性结果

样品平均峰面积为313 689.86，RSD为0.68% ，说明在12小时内样品溶液的稳定性良好。

3.6 回收率结果

结果表明该实验的回收率在101.07%～103.85%，从表1中可以看出，用此方法测定咖啡因含量具有较好的准确度。

3.7 样品含量测定结果

按2.4项中的方法对三批具有减肥功能的碧生源茶类中的咖啡因进行含量测定，结果这三批减肥茶中中咖啡因的含量在6.0～7.3 mg/g范围内。详见表2。

4 讨论

对流动相比例、流速、柱温进行考察，实验表明在流动相比例为甲醇∶水（体积比）=20∶80、流速为0.2 mL/min、柱温为30 ℃时，出峰保留时间适中，峰型较好。此法采用的流速为0.2 mL/min，并且柱压大小合适，能准确测定出样品中咖啡因的含量。若降低流速为0.1 mL/min，则咖啡因的出峰时间拖后，不利于试验效率。若提高流速为0.3、0.4 mL/min则咖啡因出峰太快的同时，也降低了检测咖啡因的灵敏度。这是因为在低流速下雾化，易于达到库伦分裂条件，有利于产生离子，提高信号强度。因此，为保证出峰时间和试验效率，选择0.2 mL/min作为最佳的流速选择。

进样量对于液质联用仪的影响。进样量是直接影响信号的响应，大进样量可以提高灵敏度，但是受色谱柱载样量的限制，而且对色谱柱以及质谱仪的损害较大。所以应当越小越好。在梯度洗脱时，可以加大进样量以提高灵敏度。本试验中采用进样量为0.1 μL，在保证灵敏度的同时，也降低了溶剂效应，减轻了对仪器和色谱柱的负担。

本研究采用了超高效液相色谱仪-质谱联用仪（UPLC-MS）建立咖啡因含量测定方法并完成方法学考察并对其进行了适用性考察。该方法出峰时间短，不存在咖啡因与减肥茶中各杂质分离的问题，也不需要通过比对光谱来进行定性鉴定，可用于各类减肥茶以及含茶类减肥产品中咖啡因的含量测定。