肺结核病相关miRNA的研究现状

张倩 冯喜英 久太

一、肺结核的流行病学

肺结核病(tuberculosis)是通过呼吸道传播的疾病，对人类健康及国民经济造成巨大损失[1]，2015年全球结核病报告显示，全球约有960万新的肺结核病例[2]，中国仍是结核病高发国家之一，占全球总负担的 15%[3-6]。肺结核主要好发于青壮年，而这部分人群是社会和家庭财富的主要创造者，青壮年患肺结核更容易导致家庭因病返贫、因病致贫，而且对社会经济发展及其不利[7]，但至今为止尚仍没有特异性适用于所有类型肺结核的快速诊断检测方法。寻找快速准确的诊断方法仍是目前结核病诊疗的首要任务，同时也是防治结核病的重要环节[8-9]。

二、肺结核相关免疫学机制

当人体通过呼吸道感染结核分枝杆菌后，其大多数并不发病，其主要原因是人体的保护机制，发挥主要作用的是细胞免疫。T细胞在细胞免疫中起重要作用，巨噬细胞是主要的起始和效应细胞。T细胞可产生免疫调节剂，如干扰素γ(interferon gamma, IFN-γ) 、白细胞介素 (interleukin, IL) 12和淋巴毒素α。外周T细胞通过识别结核菌抗原刺激IFN-γ和肿瘤坏死因子α的产生来发挥作用[10]；当感染结核杆菌，自身的免疫系统将会开启，释放出巨噬细胞吞噬结核杆菌，可以使结核杆菌丧失其生存环境, 降低结核杆菌的活性，之后受感染的细胞及巨噬细胞进行自主凋亡过程, 清除机体受损[11]。然而，研究发现B细胞在抗结核中有重要的保护作用[12]。位于淋巴器官生发中心的B细胞通过很多方式发挥作用[13]：①它可以充当抗原呈递细胞并影响T细胞的活化，从而在抗感染的防御中发挥作用;②可通过产生影响T辅助细胞反应的细胞因子在抗感染的防御中发挥作用；③B细胞可产生抗体，抗体通过调理作用、补体激活以及增强FcR介导的Mtb吞噬作用和杀伤作用来影响肺泡腔内感染，抗体并通过形成免疫复合物来清除免疫调节性Mtb抗原。综上所述，B细胞在结核分枝杆菌感染时发挥作用。

三、miRNA概述

miRNA既为微小RNA，是近年来在许多真核细胞及病毒中发现的源自内源性染色体的非编码单链调控RNA。miRNA在动物体内的炎症反应和免疫机制中起着重要作用[14]，miRNA 可以调控许多生物学的过程，如细菌感染、细胞凋亡、细胞增殖、胚胎发育、细胞代谢、器官分化、信号通路等和多个生理和病理过程。近年来随着对miRNA研究深入，结核病患者体内一些特异表达的miRNA越来越得到重视[15]。鉴于血清miRNAs具有检测手段较简便、易于收集、保存时间长等特点，且具备作为疾病分子生物标志物的优点，它很可能在肺结核的诊断和预后方面具有潜在的医学价值。

1. miR-155: miR-155是目前公认的参与众多生物过程的miRNA，例如感染、炎症和免疫等[15]。研究表明结核分枝杆菌感染后miR-155的表达明显升高，可作为肺结核诊断的潜在标志物[16]。研究表明在结核分枝杆菌感染后会引起细胞的自噬作用。自噬是一种防御和应激调控机制，细胞主要是通过自噬和溶酶体消除、降解和消化受损、变性、衰老成为失去功能的变性蛋白质、细胞器及其核酸等生物大分子。然而，自噬过多或过少均反过来危害细胞本身，自噬作用与自噬蛋白呈正相关(ATG1-ATG5)。研究发现，在被结核分枝杆菌感染的树突状细胞中，结核分枝杆菌诱导miRNA-155下调ATG3， 下调的miR-155与ATG3 mRNA的3′UTR区域相互作用，导致蛋白质水平降低，这将导致包浆型LC3(LC3I)转化为自噬型LC3(LC3-Ⅱ)，导致自噬[17]。综上miRNA-155在结核病的发病机制中起着重要的作用。

2. miR-144: 吕艳等[18]通过对比肺结核治疗前后miR-144的变化水平，提示在活动性肺结核中miR-144呈现高表达，在治疗好转后miR-144呈下降趋势。张立营等[19]通过研究活动期肺结核外周血中miR-144的表达水平与其血浆中的IL-6、TNF-α、IFN-γ水平的相关性，发现外周血miR-144的表达水平与IL-6、TNF-α、IFN-γ的浓度呈负相关，这与Liu等[20]提出的观点不谋而合。Liu等[20]研究提出miR-144可以抑制TNF-α和IFN-γ的产生，由于TNF-α和IFN-γ在保护性免疫中具有重要作用，因此提示miR-144 可能通过调节T细胞产生细胞因子(TNF-α和IFN-γ)来调节结核分枝杆菌的免疫过程。此外他们还提出miR-144可通过作用于转录激活因子(Jak-STAT)信号传导、Janus激酶/信号转导、MAPK信号等传导途径的基因而发挥负调控作用。因此miR-144的表达水平极有可能影响结核病的发展和结局。

3. miR-29: 动物实验及临床试验均表明在感染结核分枝杆菌后miR-29明显升高[21-22]，miR-29主要通过下调IFN-γ来减弱机体对结核分枝杆菌的免疫应答。除靶向调控3'UTR IFN-γmRNA外，miR-29还可以促进IFN-γmRNA与Argonaute 2(Ago2)蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物，从而在转录中抑制IFN-γ的表达[23]。此外，研究表明，miR-29也可以靶向调节抗凋亡的p85α激酶和B细胞淋巴瘤2基因(Bcl-2)蛋白、GTPβ结合蛋白Cdc42以及髓样细胞白血病-1基因(Mcl-1)蛋白[24-25]，这表明 miR-29在调节免疫细胞的凋亡途径中起着关键的作用。 因此，结核分枝杆菌感染中miR-29的高表达可部分解释结核分枝杆菌通过抑制IFN-γ和增加细胞凋亡以避免巨噬细胞吞噬的作用机制。有趣的是，在非致病的分枝杆菌感染模型中，miR-29表达下调。在NK细胞和T细胞中，牛分枝杆菌卡介苗可下调miR-29表达并诱导IFN-γ表达[26]。 综上所述，miR-29表达升高可能抑制了T细胞的IFN-γ产生，并且miR-29的表达受到分枝杆菌菌种特异性毒力的影响。

4. miR-let-7: 早期研究表明，miR-let-7家族在机体对病原体的免疫应答反应中起着重要的调节作用。Kumar等[27]的研究结果显示：结核分枝杆菌感染可显著降低巨噬细胞中miR-let-7 的表达水平，而miR-let-7 的下调表达与结核分枝杆菌分泌的ESAT-6蛋白密切相关。A20(锌脂蛋白A20基因)作为 miR-let-7的靶基因，是NF-κB通路的一种拮抗剂，结核分枝杆菌染后，巨噬细胞中miR-let-7的低表达上调了A20基因的表达，从而减弱NF-κB通路的活性。另外，该研究还指出，在缺乏A20的巨噬细胞中，结核分枝杆菌的生长速度减慢，而TNF、IL-1、亚硝酸盐等细胞因子的合成是增强的；换言之，诱导巨噬细胞内miR-let-7的高表达会减弱结核分枝杆菌的生存力，进而增强细胞因子TNF、IL-1及亚硝酸盐的合成。综上所述，miR-let-7通过特异性靶向抑制A20基因的表达来增强NF-κB通路的活性，产生和释放各种细胞因子，从而促进巨噬细胞凋亡并控制巨噬细胞内结核分枝杆菌的生长和繁殖速率。

5. miR-223: Dorhoi等[28]的研究表明，结核病患者的单核细胞中miR-223水平明显上调，并指出 miR-223可以负向调节巨噬细胞的细胞因子产生。miR-223可通过转录后调控机制抑制中性粒细胞趋化因子如CXC趋化因子配体2(CXCL2)、趋化因子配体8(CXCL8)、CC趋化因子配体3(CCL3)和白细胞介素6等的表达，从而阻止大量中性粒细胞趋化至肺组织而导致的病理损伤，发挥对机体的保护作用。Cliff等[29]的研究表明miRNA-223的缺失导致嗜中性粒细胞浸润减少并随后加剧肺部炎症，特别是在肺结核病理学过程中格外显著，这也印证了miRNA-223的表达上调对肺结核感染时发挥的保护作用。Liu等[30]的研究提示：miR-223通过抑制单核细胞来源的巨噬细胞中的p65磷酸化和核移位来负性调节NF-κB的活化，从而抑制体内细胞因子的表达，并进一步抑制巨噬细胞的凋亡，从而抑制机体的抗结核免疫。综上所述，肺结核感染中miR-223表达的上调在机体免疫中起着重要的保护作用。

6. miR-21: 相关研究表明：miR-21抑制炎症细胞因子的表达并促进炎症细胞因子IL-10的产生[31]。最近的研究发现，在被牛分枝杆菌感染后，无论在体外或体内，在未致敏的树突状细胞和巨噬细胞中均可通过TLR / Erk / NF-κB途径上调miR-21的表达[32]。miR-21在早期结核分枝杆菌分泌的抗原性靶蛋白(相对分子量为6×103)抗原攻击巨噬细胞后表达呈上调，在抗原呈递细胞中降低miR-21活性，显著促进机体抗分枝杆菌免疫的作用。miR-21还可通过直接靶向3′UTR IL-12 mRNA来抑制IL-12的表达，从而抑制宿主Th1的应答。此外，研究还发现miR-21在抑制结核分枝杆菌感染中，具有保护性细胞因子如TNF-α、IL-6基因的表达，但是这些细胞因子水平在ESAT-6暴露后并没有显著改变。有趣的是，miR-21也通过靶向调节Bcl-2促进树突细胞凋亡，这也证实了以前的发现：既结核分枝杆菌可诱导被感染细胞凋亡，但miR-21可调控Bcl-2表达的机制尚不清楚。另外，miR-21通过诱导抑制IL-12的产生触发更有效的抗分支杆菌应答。因此，miR-21可能是分枝杆菌可用于逃避宿主免疫应答并建立慢性感染的有效机制。

随着研究的深入，大量科学证据表明miRNA参与结核病感染的进程，并在基因的表达调控机制中起着重要作用。 此外，研究发现血液，痰液和胸腔积液的特定miRNAs在区分结核感染和健康个体、活动性和潜伏性结核感染、结核和其他感染以及肺部疾病方面有重要意义，并且miRNAs具有易收集、稳定性好等优点，故miRNAs可作为结核杆菌感染的潜在诊断依据，以及作为评估结核病治疗进程中的生物标志物。但目前miRNA的研究分析尚未覆盖少数民族及不同海拔高度的人群。相信随着对 miRNA 研究的不断深入，对少数民族及不同海拔高度人群结核相关的miRNA发现；将会提出关于肺结核的更准确、更有临床价值的特异性的miRNAs，并为结核病诊断与治疗提供新的思路与策略，推动结核病诊断与治疗的发展。