MicroRNA在肺癌早期诊断中的研究进展

冯洋洋 徐兴祥

肺癌是全世界范围内导致癌症相关死亡的主要原因[1-2]。特别是在中国，肺癌病死率每年达50万以上，严重威胁公众健康。其原因是大多数肺癌患者在无症状期时不易发现，当出现症状时多已处于晚期，因此大多数肺癌患者在初诊时已发生远处转移，导致肺癌预后差，生存率低[3]。尽管自1970年以来对肺癌进行了大量研究，但肺癌的预后仍不乐观，病死率仍未见明显改善(五年生存率80%～85%)，其原因主要有两个方面，首先是缺乏对早期肺癌有高灵敏度及特异度的诊断方法，其次是缺乏对进展期肺癌的有效治疗策略[4]。有关肺癌的筛查试验表明，肺癌的早期检测能够改善肺癌患者的长期生存。超过50 000例患者应用低剂量CT扫描或胸部X线进行了筛选，CT扫描筛查的患者中，有24%的阳性检出率，使肺癌特异性病死率降低了20%，可见肺癌高危人群的早期诊断对其预后及生存具有重要意义。但在这24%的阳性结果中有96%为假阳性[5]。2017年NCCN最新版肺癌筛查指南对肺癌高危人群的定义为年龄在55～74岁之间，吸烟史大于30包/年且戒烟少于15年，或年龄>50岁，吸烟史大于20包年，存在除二手烟以外的上述危险因素之一[6]。面对如此庞大的肺癌高危人群，肺癌的早期诊断至关重要。除了上述的低剂量CT已被广泛应用肺部的早期筛查，近年来miRNA对恶性肿瘤的早期诊断价值越来越受到重视， miRNA在包括肺癌在内的肿瘤患者的血液、体液中显著高表达。现就近年MicroRNA在肺癌早期诊断中的研究进展作一综述。

一、MicroRNA及其生物学功能

MicroRNAs是一类内源性非编码小单链RNA(19～24个核苷酸)，最初在线虫体内被发现[7]。目前在人类体内至少有1 000个基因位点编码miRNAs。miRNAs作为转录后调节因子调节基因的表达，且与信使RNA的表达有关，此类分子能通过与目标miRNAs3’端非翻译区结合抑制基因的翻译过程或降解信使RNA，一些miRNAs可能存在成千上万的目标mRNAs,生物学信息数据资料表明至少20%～30%人类基因的转录过程受到miRNAs的调节[8-10]。miRNAs除在肿瘤组织中能够被检测到，其在血浆、血清及尿液中也有表达。研究表明，miRNAs在血液中很容易被检测到，主要通过三种不同的机制释放入血，分别为裂解细胞被动漏出、细胞微泡主动释放、以微泡形式主动分泌[11-12]。另一种尚未明确的机制为外泌体内的miRNAs的胞外释放，外泌体是细胞内与多囊泡体融合的小薄膜囊泡，能够释放进入细胞外微环境[13]。研究报道肿瘤细胞较正常细胞释放更多的外泌体miRNAs[14]。此外，miRNAs在不同的生物标本中有较高的稳定性，主要是因为其对内外源性的RNA酶、极端温度和pH、重复冰熔循环有较高的抵抗力[11-12, 15-16]。因此，miRNAs在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。

二、MicroRNA在恶性肿瘤中的表达

研究表明，在许多种肿瘤中均检测到miRNAs异常表达，miRNAs在肿瘤发生中扮演重要的角色[17]。Hayashita 等[18]发现miRNA17-92在肺癌中显著上调，特别是在小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)更明显。miRNA-21在乳腺癌、肺癌、胃癌及前列腺癌中呈过表达[19]。miRNAs可能是通过调控癌基因、抑癌基因的表达及改变细胞内信号通路促进肺肿瘤的发生，如Let-7家族可负调节RAS癌基因表达，而let-7在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中检测到呈低表达[20]。miR-196a在肺癌组织中检测到呈高表达，且主要是在肺上皮细胞的PI3K/AKT信号途径下游发挥作用，通过调节FoxO1、CDKN1B (hereafter p27) 和HOXA9的表达，促进肿瘤的发生、转移及增殖[21]；另一实验证实MiR-18a-5p在NSCLC肺组织中显著高表达，其通过抑制干扰素调节因子2(interferon regulatory factor 2, IRF2)的促凋亡、抑生增殖及转移的作用促进肿瘤生长[22]。miRNA-21通过抑制凋亡相关蛋白4抗体(programmed cell deanth 4, PDCD4)的表达及激活PI3K/AKT/mTOR 信号途径降低NSCLC患者的化疗敏感性,使肺癌患者治疗效果不佳[23]。值得注意的是，miRNAs也可能直接作为癌基因及抑癌基因在肿瘤的发生过程发挥作用， miRNA能够直接调控肿瘤细胞的生长或通过调节转录因子及信号通路间接调控细胞的凋亡参与肿瘤的发生。let-7、miRNA15a与miRNA-16-1为肿瘤抑制基因，而miRNA-17-92、miRNA-155与miRNA-373被认为是致癌基因。因此，肿瘤的发生与miRNAs的异常表达存在高度联系。miRNAs在恶性肿瘤中的表达与其诊断、分期、进展、预后、转移及对治疗的反应有着密切的关系。

三、循环中miRNA

miRNAs在肺癌患者血液中异常表达，其灵敏度及特异度各有不同，每项实验研究检测到的miRNA类型也缺乏一致性。研究发现Ⅰ、Ⅱ期的NSCLC患者血液中的六种miRNAs(miR-205, miR-200b, miR-125b, miR-34b, miR-429, miR-203)表达显著升高，其中miR-200b具有最高的灵敏度及特异度。6种RNAs总的灵敏度及特异度为85%、74%，如从临床角度考虑，进一步降低阈值，其灵敏度及特异度会进一步提高[24]。研究表明六种miRNAs(miR-103, miR-146a, miR-151-3p, miR-221,miR-222, miR-223)在肺腺癌(adenocarcinoma, ADC)患者中呈高表达。其中，miR-146a，miR-222和miR-223三者总的有效阈值、灵敏度、特异度分别为0.5015、84.35%、90.83%，在各预测模型中最高，其诊断ADC的准确性为90.83%。与健康组相比以上三种miRNAs在Ⅰ、Ⅱ期肺癌中的AUC分别为 0.942、0.968，表明其在ADC患者早期诊断中有应用价值[25]。一项对99例Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者血浆标本的分析发现，六种miRNAs的表达较正常及良性疾病组显著升高，其中miRNA30a上调最明显，但在不同病理类型(腺癌、鳞癌、SCLC)中无统计学差异，与NSCLC的临床特点也无明显相关。实验显示miRNA30a的AUC为0.727，诊断阈值为0.061，灵敏度及特异度为61.0%、84.3%.表明miRNA30a可作为肺癌早期诊断的有价值指标[26]。另一项关于早期NSCLC诊断的实验发现miR145、miR20a、miR21、miR223在肺癌组中表达显著升高，四者的 AUCs 介于0.809～0.889，最佳阈值在1.101～4.086，此阈值四者的灵敏度及特异度为89.2%～79.8%；85.5%～69.8%。四者联合检测有最高的NSCLC预测准确度，AUC、分界值，灵敏度及特异度，分别为0.897，1.485，81.8%和90.1%。并且该实验证实术后肺癌患者血液中以上四种miRNA的表达较术前明显降低[27]。2015年一项研究表明miRNA-125a-5p,miRNA-25及miRNA-126在早期肺癌血清中的灵敏度及特异度均为87.5%[28]。同年，另一研究证实miRNA-194, 652,和660联合检测的灵敏度及特异度为85.9%、93.4%，并与一个研究组织合作证实miRNA-483-5p，193a-3p，214，25，7联合检测也具有较高的敏感性和特异性，为89%和68%[29-30]。miRNAs在肺恶性孤立性肺结节(solitary pulmonary nodule, SPNs)患者血浆中亦有表达，所测miRNA-21、210、486-5p、miRNA-126的灵敏度及特异度分别为76.3%、86.2%、85%和97%[31-32]。

上述研究检测到多种miRNAs在肺癌患者血液中呈高表达，且多种miRNAs的联合检测较单一miRNA鉴别肺癌的灵敏度及特异度明显提高。研究报道miR145、miR20a、miR21、miR223四者单独鉴别肺癌的灵敏度及特异度范围分别为69.8%～80.6%、84.3%～89.2%，而四种联合鉴别肺癌的灵敏度及特异度分别提高到了81.8%、90.1%[27]。可见，miRNA不仅可以作为肺癌早期诊断的有效标志物，且多种miRNAs联合检测可提高其诊断准确性。

四、痰液及肺泡灌洗液中miRNA

在肺癌的检测中，痰液提供了miRNAs的有效来源，miRNAs存在于肺癌细胞中，并脱落进入呼吸道最终以痰的形式咳出体外。一项单一痰标本实验显示miRNA21、143、155、210、372在早期NSCLC中的灵敏度及特异度为83.3%、100%。后续分析发现，miRNA21、210、372在其中占主要地位，miRNA21、210、372在早期肺癌组(NSCLC Ⅱ期)中三者的灵敏度及特异度为67%、90%，阳性、阴性预测值为93%、56%[33-34]。另一项小样本量的可行性研究评估了miRNA-21在NSCLC与非癌性患者痰标本中的表达差异，发现肺癌患者痰标本中miRNA-21的表达较对照组显著升高，其灵敏度为69.66%，特异度为100.00%[35]。与单一的miRNA测定相比，miR- 21, miR-486, miR-375和miR-200b的系列检测在鉴别早期肺腺癌(Ⅰ期)中有最好的预测性，灵敏度及特异度为80.6%、91.7%[36]。研究发现miR-205诊断肺鳞癌的灵敏度及特异度为96%、90%，预示着其可能成为诊断肺鳞癌的高度精确标志物[37]。相似的实验发现miR-205, miR-210及miR-708三者序列检测鉴别肺癌的灵敏度及特异度为73%、96%，与任意单一miRNA检测比较，三者联合检测具有最好的预测性[38]。

虽然评估肺癌患者痰中的miRNAs的文献较少，但是与血液相比较痰是一种很有潜力的生物样本，因为痰标本的采集对患者来说是完全无创的，并且其分析也较简单。此外，miRNA在痰中的表达水平是非常稳定的，痰标本采集后第1天到第7天miRNA的表达水平不会发生改变，该特性使其可作为一个有潜力的生物样品用于检测miRNA[35]。 利用清晨痰标本或单个患者重复多次采集标本分析能够显著提高痰标本的诊断率。

除血液和痰外，近年来肺泡灌洗液诊断肺癌的价值受到越来越多的关注，已有研究对肺泡灌洗液中肿瘤标志物及蛋白标志物进行了报道，但对肺泡灌洗液中microRNA的研究很少，有研究显示肺腺癌患者肺泡灌洗液外泌体中miRNA(miRNA-126)较对照组显著高表达[39]。miRNA-10b在NSCLC患者肺泡灌洗液中显著高表达，AUC值为0.931，且miRNA-10b高表达与肺癌的临床分期有高度的一致性，预示miRNA-10b可作为NSCLC筛查的可靠标志物[40]。但肺泡灌洗液需在支气管镜下冲洗气道后回收灌洗液获得，费用较高且患者的依从性差，因此其较血液及痰更难获得。

当前CT筛查肺部结节已得到广泛应用，因此miRNAs与CT相结合进行肺癌筛查与诊断将是一项有意义的研究，研究显示，miRNA-126，139和429在肺癌人群与对照组相比，敏感性和特异性分别为72%和95%[38]。有研究利用同一群体评估miRNA-31和210序列区分健康对照组与ADC或SCC患者的能力，该研究还对CT联合miRNAs序列检测鉴别肺癌的能力进行了评估，结果证实，CT联合miRNA序列检测表现出了更高的特异性(91.2%、 83.8%)和相近的敏感性(92.4%、93.9%)。可见，miRNA联合CT能够显著提高肺癌的诊断率。

理想的肿瘤标志物其特异度、灵敏度应与肿瘤负荷成正比，早期的大量文献已表明循环miRNAs可满足此标准。自从在肺癌患者血液中检测到miRNA，大量研究致力于检测可用于肺癌筛查、诊断及预后判断的关键miRNAs。尽管此领域有巨大的发展潜力，循环miRNAs作为肺癌检测的生物标志物仍需大量研究以证实。其一，建立简易标准的分析法对各种体液中的miRNAs进行定量分析，对循环miRNAs的特异度及灵敏度尚需要大样本实验予以评估。其次，特定的肿瘤相关循环miRNAs应被开发为肺癌早期诊断的生物标志物，其在肺癌发生发展中的作用机制也应予以明确。最后，随着循环miRNAs检测与分析方法的不断进步，检测工具也必须具备反映检测与分析两方面的能力。特定循环miRNAs的广泛适应性与潜在重要性有利于开发为可重复、可靠地生物标志物，并应用于肺癌的检测、诊断与预后判断。