山羊精液冷冻保存技术研究进展

吕玉华,廖荣荣,林月霞

（上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106）

山羊是人类最早驯化的家畜品种之一，可以为人类提供高营养的肉类和御寒用的皮毛。山羊肉是一种高品质的健康食品，胆固醇含量低，人类所必需的氨基酸含量高。随着生活水平的提高，山羊肉的消费需求越来越大。目前，国家正大力提倡发展草食动物养殖业，作为主要的草食动物之一，山羊养殖规模随着需求增加而不断扩大。随着肉羊的规模化、产业化养殖的推广，对优质山羊冷冻精液的需求也越来越大，使用山羊冷冻精液及人工授精技术可以极大地促进优秀种公羊的推广与利用，改善羊群结构，从而降低养羊生产成本，提高养殖收益。

精液稀释后在常温（15—25℃）条件下仅可保存数天，而在冷冻（-79℃或-196℃）条件下则可长期保存。近年来，精液冷冻保存技术得到了长足的发展，如在冷冻保存方法的改进和冷冻稀释液的完善等方面［1］，冻精复苏后的活力有了极大的提升，受精能力也得到了很大的提高。但冷冻保存仍然存在诸如冷冻精液精子活力不高和顶体完整率低等问题。本文从山羊冷冻精液稀释液的理化指标、稀释液添加剂和冷冻保存方法等方面对影响山羊冷冻精液质量的因素进行综述，以期为山羊精液冷冻保存技术更好地应用于肉用山羊养殖提供参考。

1 山羊精液冷冻保存

1.1 精液冷冻保存研究历史

山羊精液冷冻保存，即将优秀种公羊的精液置于超低温环境中保存，使精子的新陈代谢达到或接近停滞状态，待到使用时，通过复苏使精子复活并有比较强的受精能力。精液冷冻保存技术可以大大促进优秀种公羊的推广与利用，也可以减少大量饲养种公畜所需的高昂成本，并能有效地避免疾病通过生殖渠道传播。

人类很早就开始了精液冷冻技术的尝试，但直到20世纪40年代后，家畜精液冷冻技术才得到较快发展。Smith等［2］使用甘油进行了美利奴羊精液的低温冷冻保存研究。山羊精浆中含有特殊的蛋黄凝结酶，冲洗离心法处理山羊精液去除精浆，可减少磷脂酶或类磷脂酶等对精子的损害，这对山羊精液冷冻保存贡献很大［3］。Tuli等［4］从冷冻精液复苏温度着手，研究了复苏温度对波尔山羊精子运动能力及谷氨酸草酰乙酸转氨酶释放的影响，发现冷冻精液在70℃复苏7 s的效果最好。此外，研究人员还从采精方法［5］和精液的冷冻保存温度、降温速率［6］、冷冻稀释液的理化指标［7］、冷冻保护剂［8-10］等方面探讨了精液冷冻保存技术。

1.2 存在的主要问题

山羊精液冷冻保存是家畜种质资源保存的一个特殊挑战，其主要原因是缺乏最理想的山羊精液冷冻保存准则。精液的冷冻保存是先将精液与稀释液按配比混合并保存在超低温冰箱或者液氮中，冷冻保存所用的稀释液以及稀释液中所添加的保护剂等都很重要［11］，稀释液的一个重要作用是降低精子在冷冻降温和复苏解冻过程中受低温损伤的程度。

山羊体内分泌的脂肪酶可以和蛋黄脂质或脱脂乳的甘油三酯结合，产生对精子细胞有害的物质。当前常用方法是用离心法去除精清（也叫精子清洗），但该步骤费时且繁琐，并有可能导致精子细胞的丢失或损伤。尽管在山羊精液冷冻保存方法的改进、冷冻稀释液的完善等方面取得了很大的进步［12］，冻精复苏后的活力有了极大的提升，冻精的受精能力也得到了比较大的提高，但山羊精液冷冻保存仍然存在诸如冷冻精液复苏后精子活力不够高、顶体完整率较低、精子畸形率较高以及冻精的受精能力不足等问题［13］。因此，与鲜精相比，山羊冻精的利用率仍然比较局限。冷冻保存过程中一系列的生理生化反应及分子机制还有待更深入的研究，以促进精液冷冻保存技术的进一步发展。

2 稀释液的理化指标对冷冻精液的影响

作为精液冷冻保存的媒介，精液稀释液的主要作用是降低精子在冷冻降温和复苏解冻过程中受低温和冰晶损伤的程度，并给精子提供合适的环境。稀释液应具有缓冲性和低温保护性能，还应该是水溶性的且不能渗透细胞膜。适宜的冷冻精液稀释液对精液冷冻至关重要。此外，稀释液还必须要符合精子的生物学特性，其中pH和渗透压是制备精液冷冻稀释液需注意的两个主要理化指标。

2.1 pH

精液pH的异常波动将会导致精子损伤甚至死亡。精清的一个重要作用就是为精子提供缓冲以对抗pH的波动，而在体外进行山羊精液冷冻保存时精清已被去除，因此，为了维持冷冻精子的活力和受精能力，必须控制好冷冻稀释液的pH。山羊鲜精的pH是7.2—7.5，此时精子的氧气摄入量最大，而精子的运动能力在pH 7.0—7.2时最理想。通常，山羊精液稀释液的pH为6.0—7.5，但不同科研人员对pH的范围存在不同见解。

稀释液的pH随着冷冻保存时间延长逐渐降低，而冷冻保存精子的活率和稀释液的pH呈强相关。稀释液中添加葡萄糖时，精子可以此为能量进行代谢并产生弱酸性的乳酸盐［14］。蛋黄可以增强精子对pH变动的耐受力，如果稀释液中含有蛋黄或奶粉，则一般建议pH在6.25—6.8。

对于精液冷冻保存，常通过降低精液稀释液的pH使精子处于弱酸性环境，这样既不会危害精子，又可以有效抑制精子运动，从而有利于精子的保存。可见，维持稀释液恒定的pH对于保持精子活力和受精能力有着重要意义。

2.2 渗透压

山羊精子在含不同种糖类、盐类和缓冲剂的冷冻稀释液中都可以生存，但稀释液的渗透压只可在一个很小的范围内浮动。高渗的冷冻稀释液更适合于山羊精液冷冻保存。通过使用含浓缩蔗糖的稀释液，Farshad等［15］认为山羊精子在冷冻阶段可以耐受560 mOsm的渗透压。Salamon等［16］研究表明，用以Tris碱和柠檬酸葡萄糖为主要成分的稀释液时，山羊精子所耐受的最佳渗透压是540 mOsm。此外，有研究指出，相对于325 mOsm和625 mOsm的渗透压，山羊精子在渗透压为425—525 mOsm的冷冻稀释液中的损伤更低［17］。总之，冷冻稀释液的主要成分和浓度不同，其渗透压可以有一定的范围变动，根据已有的研究结果，冷冻稀释液的渗透压在425—560 mOsm时对山羊精子的冷冻保存效果最好。

3 添加剂对山羊冷冻精液的影响

山羊精液冷冻稀释液主要包含有非渗透性防冻剂（奶粉或蛋黄）、渗透性防冻剂（甘油、乙二醇、二甲亚砜）、缓冲液（Tris或者Test）、一种或多种糖类、盐类（柠檬酸钠或柠檬酸）和抗生素。稀释液成分和含量对精子保护起着决定性的作用。研究指出，甘油［15］、维生素［6］、卵黄［3］等添加剂对精子有重要的保护作用。

3.1 冷冻保护剂

甘油是当前最常用的一种冷冻保护剂。甘油作为一种主要的渗透性抗冷冻保护剂，是精液冷冻保护里程碑式的发现，其可以保护精子在降温、冷冻和复苏过程中少受低温的伤害［2，15］。

Anakkul等［18］研究表明，冷冻稀释液中10%的甘油添加使得解冻后的精子可以使母羊有60%的怀孕率。甘油的添加方式也关系到冷冻保存效果，在冷却到4℃时，以10 min为间隔分3次添加甘油的保存效果最好。

渗透性保护剂的最终添加比例取决于该物质对精子的保护作用及其自身毒性的大小。甘油浓度不宜过高，因为精子顶体损伤率会随着甘油浓度增加而上升。不同研究人员使用的甘油添加量在3%—10%，而稀释精液中4%—7%的添加是最理想的［17］。

有研究表明，二甲乙酰胺是比甘油更好的抗氧化防冻剂，将10μmol/L和20μmol/L的栎精分别添加到含5%二甲乙酰胺和甘油的稀释液中，然后进行山羊精液的冷冻保存与复苏。通过对精子的活力参数、运动性、不正常比、膜完整性和脂质过氧化等进行检测，最终得出二甲乙酰胺的抗冻效果比甘油好［19-20］。

3.2 维生素

在正常代谢条件下，精子会产生一系列的活性氧簇（ROS），而正常情况下精子产生的ROS和抗氧化剂能达到一个平衡，从而有效防止高浓度的ROS引起细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至坏死［21］。在精液冷冻和解冻过程中，这种平衡被打破，为避免精液冷冻和解冻过程中ROS和自由基的危害，需在精液冷冻稀释液中添加抗氧化剂以有效地保护精子对抗这种危害。

维生素E是精子抗氧化系统的主要组成部分，也是质膜对抗ROS的主要保护剂。冷冻稀释液中添加适当浓度的维生素E可以有效减缓冷冻对精子的伤害，提高和田羊解冻后精子活率，并改善冷冻精液品质［22］。此外，在稀释液中添加2.5—8.5 mg/mL的维生素C可以有效提高精子活率以及顶体和质膜的完整性［6］。

维生素E和维生素C是重要的抗氧化剂，可以通过抑制自由基的形成，阻止自由基对精子膜脂质的过氧化，从而维持精子顶体质膜的完整性，提高解冻后精子顶体完整率和精子活率，最终达到提高受精率的目的［23-26］。

3.3 蛋黄

蛋黄是哺乳动物精液冷冻稀释液中重要的非渗透性防冻剂。山羊精液冷冻保存使用蛋黄作防冻剂，首先要解决精浆中蛋黄凝结酶（EYCE）的问题，因为EYCE酶可将蛋黄中的卵磷脂水解为溶血磷脂类物质，而这种物质对精子具有毒副作用［26］。所以，山羊精液冷冻保存前都要先离心去除精浆。

对于蛋黄的添加浓度，有研究指出在含葡萄糖和EDTA的稀释液中，20%的蛋黄添加使得冻后精子的活力和质膜完整性显著差于2.5%的添加组，从而得出低浓度（2.5%）的蛋黄添加更有利于山羊精子冻后活性和繁殖力［3］。刘亮等［27］研究显示，崇明白山羊精液冷冻保存稀释液中添加20%鸡蛋黄的效果比添加20%鹌鹑蛋黄更显著，解冻后的精子活力提高近10%。在以Tris为缓冲液的稀释液中，20%的蛋黄添加比不同浓度卵磷脂添加的冻后精子参数及受精胚胎发育更好［28］。

3.4 其他添加剂

除甘油、维生素E、维生素C和蛋黄等物质外，还有许多其他物质可用作精液冷冻稀释液的添加剂，如大豆提取物、胆固醇、氨基酸和番茄红素等［29］。

番茄红素作为一种抗氧化剂，可有效提高精子细胞中抗氧化酶的活性，提高冻精复苏后精子活率。稀释液中添加番茄红素1 mg/mL，可以有效提高解冻后精子的活力、线粒体活性、DNA和染色体完整性等指标［29-30］。

环糊精胆固醇包合物（Cholesterol-loaded cyclodextrin，CLC）是新发现的可用于山羊精子冷冻保存的添加剂，可提高冷冻山羊精子质膜的稳定性［9］。未去除精浆时，CLC可以有效地保护精子少受来自精浆的损害。

大豆提取物（主要是大豆卵磷脂）作添加剂可以有效地保护精液，能极大地降低冷冻保存对精子活力的损伤，同时可以省去繁琐且耗时较多的山羊精液冷冻所需的精浆去除步骤，可以作为蛋黄的有效替代物［31-33］。此外，由于其价格相对低廉，且不含动物源性病毒，大豆提取物更适宜用于规模化冻精生产实践。胆固醇在精子质膜流动性、冷刺激敏感性和冷冻损伤等方面起着重要的作用，胆固醇的添加可以有效地提高冻后精子活力和精子受精力，特别是在有蛋黄存在时，胆固醇的保护效果最好［12］。此外，稀释液中添加氨基酸也可以提高冷冻精子的冻后活力［34］。

4 冷冻保存方法对精液冷冻保存的影响

4.1 精浆处理

精浆是精液中的液体成分，山羊的精浆含有特殊的蛋黄凝结酶（EYCE），因为EYCE酶可与脱脂乳或蛋黄反应，产生对精子具有损害作用的物质，所以，进行山羊精液的冷冻保存首先要将精浆去除。去除精浆是一个费时且繁琐的步骤，还会造成精子细胞的丢失或者损伤。Salmon等［9］提出了一种新的山羊精液冷冻保存方法，即直接进行冷冻保存而不去除精浆。该方法是在稀释液中添加3 mg/mL的环糊精胆固醇包合物（CLC），CLC可提高冷冻保存山羊精子膜的稳定性，并且在未去除精浆时，CLC可以有效地保护精子少受来自精浆的损害。此外，使用大豆提取物（主要是大豆卵磷脂）作为添加剂也可以省去繁琐耗时的精浆去除步骤，并可以有效地保护精子，能极大地降低冷冻保存对精子活力的损伤［33］。

4.2 精液冷冻保存方法

精液冷冻保存主要有颗粒法和细管法，颗粒法保存比较方便快捷便宜，但不利于系统化管理，而细管法易于标记且适合系统化管理，是当前冷冻精液保存的主流方法。两种方法都需先将精液冷却到4—5℃平衡1.5—4 h，颗粒法是将0.1—3 mL的精液滴到有锯齿的干冰（-79℃）中，再平衡2—4 min，最后将精液颗粒投入液氮中保存；在细管法中，稀释精液经4℃平衡后用0.25 mL或0.5 mL的细管分装，在距离液氮表面2—4 cm处熏蒸7—8min，最后投入液氮中保存［9］。目前，已经有针对细管法生产的控温仪、全自动精液分装机和细管打印机，细管法精液冷冻已经成功进行了商业化生产。

对精液冷冻保存的研究显示，熏蒸距离越近，熏蒸时间应缩短，熏蒸距离越远，熏蒸时间应相应延长。研究表明，最佳熏蒸距离是2 cm和熏蒸时间为7 min，解冻后的精子活力为42.33±3.96［35］。又有研究指出，熏蒸高度应该由细管尺寸决定，0.5 mL的细管应该在4 cm处熏蒸5 min，而0.25 mL的细管则在16 cm处熏蒸2 min即可。

冷冻保存的精液在使用时需要先复苏，而复苏过程对精子复活率的影响很大。冻精的复苏主要是将冻精麦管置于温水中融解。有研究指出，相对于在38℃温水中融解60 s，冻精麦管在60℃热水中融解7 s可以有效地提高复苏精子细胞膜功能完整率［35］。可见，在高温水中快速融解可以降低再结晶现象对冻精的伤害。

5 结论与展望

精液冷冻保存技术的快速发展，使得精液的利用突破时间、地域和种公羊等限制成为可能，同时也有利于山羊种质资源保存。联合使用精液冷冻技术和人工授精技术，可以极大地提高优良种公羊的利用率，加速品种的育成和改良步伐。

然而，影响山羊精液冷冻的因素很多，如保存方法、保存温度、冷冻速率、稀释液的化学成分、冷冻保护剂的种类及浓度等。精子质膜富含多聚不饱和脂肪酸，这会使精子在低温过程中变得对ROS很敏感，所以，需要在冷冻稀释液中添加维生素E和维生素C等抗氧化剂。随着山羊精液冷冻技术和人工授精技术的发展，使用冻精的母羊情期受胎率将越来越高。

精液冷冻保存与复苏是复杂的生理生化过程，这个过程给精子带来的损伤主要有物理性损伤、化学性损伤和氧化应激损伤，这些损伤对复苏后精子完整性和精子活力等指标有深刻影响，这也是山羊精液冷冻保存技术推广受限的主要因素。精液冷冻对精子印记基因DNA甲基化等表观遗传以及相关基因表达都会有较大的影响。总之，精子在冷冻保存过程中复杂的分子变化以及复苏后繁殖力的差异，其机制还不是很明确，还需要进行深入的研究。未来山羊冻精生产实践中的突破点之一是：怎样在不去除精浆的情况下进行山羊精液冷冻保存，同时使复苏后精子活力和受精能力达到一个较高的水平。

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