精准医疗理念下宫颈癌治疗相关基因研究进展

2018-01-16王微张杰孙凤春徐兆凯

中国现代医药杂志 2018年11期

王微张杰孙凤春徐兆凯

作者单位：255314 山东淄博，齐鲁医药学院公共卫生系（王微、张杰、孙凤春）；山东新华安得医疗用品有限公司（徐兆凯）

高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）亚型的生殖道感染是导致宫颈癌发生的必要条件，在世界范围妇女中，宫颈癌（Cervical cancer，CC）是最常见的恶性肿瘤之一[1]。致癌HPV亚型的持续性感染是引发宫颈癌的因素之一，其中HPV16、HPV18型与宫颈癌发病的关系最为密切[2]，HPV16感染主要导致宫颈鳞癌，HPV18感染主要导致宫颈腺癌[3]。近年来，宫颈癌发病率逐渐上升，患者的年龄也呈年轻化趋势，研究能够特异性抑制宫颈癌发生发展的手段非常必要[4，5]。传统宫颈癌的临床治疗主要以手术、化疗、放疗等为主，其中手术治疗针对早期患者，晚期患者采用放化疗的治疗方法，复发患者的临床治疗效果较差。对于晚期不适合进行手术以及对放化疗不敏感的患者，治疗后的五年生存率并不理想。一直以来，研究者们致力于研究发现新的微创、副反应小、可以根治癌症的方法。随着医学与多学科的交叉渗透发展，尤其是“精准医疗”概念的提出，人们正研究利用分子生物学技术在基因水平对其进行治疗。本研究主要围绕精准医疗的概念及技术，对其在宫颈癌领域的治疗进行综述。

1 精准医疗计划与肿瘤

2015年1月20日，美国总统奥巴马在国情咨文中提出“精准医疗计划 (precision medicine initiative)”[6]。“精准医疗”作为一种新兴的医疗模式，是指在患者基因组信息的基础之上，结合蛋白质组学、代谢组学等相关信息，针对患者自身基因特点而制定出的最适治疗方案。在这种方案下，治疗的策略、实施等都是以诱发疾病发生的基因为基础，这种方案有别于传统的根据患者症状和体征定制的治疗方案[7]。精准医疗是以个体化医疗为基础，通过检测与疾病相关的特定生物学标志物，再根据患者的自身病史等情况，对患者制定出最优的治疗方案。精准医疗的概念是个体化医疗的延伸，是基于一组病患或人群，而不仅仅考虑个体本身的差异，更偏向于针对患有特定疾病的、有着某些相同遗传信息的人群，既大量患者中少量特定的人群，这些人群在分子层水平上有一致的致病原因，这就为精准医疗的研究提供了依据。随着近年来人类基因组测序、蛋白质组学、代谢组学、基因组学等大数据技术的飞速发展，这一概念的应用领域更为广泛[7]。

精准医疗适用于医学各个学科，但由于各种原因，肿瘤学科是精准医疗的最佳应用领域之一。在我国，癌症的发生率逐年上升，并且已成为第一死因。传统的癌症治疗方法如手术切除、化疗、放疗等，是以单一的“破坏性”治疗为主，这些方法在一定程度上给肿瘤患者减轻痛苦的同时，也存在着治疗毒副作用等弊端，如手术切除给患者造成的创伤巨大、全身化疗和放疗特异性较差，会同时对正常细胞有杀伤作用，以及其较大的毒性作用破坏免疫系统，导致患者的生存质量不理想[8]。随着医学的快速发展，尤其是伴随分子生物学技术的发展，人们对肿瘤分子病理基础研究的深入，肿瘤研究已经从细胞生物学水平，逐渐扩展到分子生物学水平。肿瘤的发生与多种因素有关，并且是多步骤发展的全身性、系统性疾病，不仅与环境因素有关，基因组的异常改变如癌基因、抑癌基因的缺失突变或基因表达调控异常是导致肿瘤无限生长与转移的主要原因。每个肿瘤都与特定癌基因的突变和相关基因表达调控的失常相关联，而这些信息是用来确定药物或基因治疗靶点的基础。因此，我们可以从分子水平发现疾病发生的共性，这对肿瘤的治疗尤为重要。

2 RNA 干扰在宫颈癌治疗中的应用

致癌型 HPV 亚型（如 HPV16、18、52）是导致宫颈癌发生的主要元凶，病毒在人体持续感染的过程中与宫颈细胞内基因发生整合，使正常细胞发生癌变，从而导致癌症的发生。高危型病毒的致癌基因是E6/E7基因，其编码E6/E7蛋白[9]。HPV16型病毒的E6和E7基因转录，是由一个共同启动子（p95）引导的，E6基因编码的蛋白与p53特异性结合后通过泛素化途径诱导p53的降解。而p53作为一种抑癌基因产物，可以促使癌细胞因DNA损伤而凋亡，E6蛋白与p53的结合可以阻断这一机制，从而抑制癌变细胞的凋亡[10]。E7蛋白与pRb的结合导致pRb发生高磷酸化，释放出的核转录因子E2F诱导细胞进入S期，从而使上皮细胞因绕过正常细胞周期检测点而发生无限增殖[11]。RNA干扰技术可以诱导相关基因发生沉默从而使其失去表达功能，其原理是细胞内的核酸酶III-Dier将导入细胞的外源或内源性双链RNA处理为21～23bp的小干扰RNA(siRNA)，siRNA再结合解螺旋酶、核酸酶等形成一种RNA沉默复合物，该复合物与特定基因的mRNA结合后将这段mRNA降解[12]。

Hong等[13]利用该技术，设计了HPV16基因启动子p95区的siRNA，将该siRNA转染SiHa细胞从而进行癌基因沉默，结果发现在SiHa细胞中E6、E7mRNA的表达量分别降低了45.2%和41.7%；E6、E7蛋白的表达量分别降低了33.3%和30.3%；癌细胞的生长和增殖受到明显抑制，细胞凋亡率明显增加。石华等[14]同时研究HPV16E6、siRNA与hIL-24基因联合诱导人宫颈癌CaSki细胞的凋亡情况，发现HPVE6癌基因的mRNA水平下降明显，抑癌蛋白p53水平增高，细胞凋亡率明显升高，说明HPV16E6siRNA能抑制CaSki细胞中HPV-16E6癌基因的表达，使抑癌蛋白p53恢复活性，诱导宫颈癌CaSki细胞凋亡。徐永芳等[15]通过体外脂质体介导的VEGFsiRNA1、2、3号链转染宫颈癌HeLa细胞株。VEGF是一种与血管形成和血管通透性有关的诱导因子，可以由不同肿瘤细胞分泌，也可在发育正常细胞及组织中表达，其作用是促进肿瘤血管生成，对肿瘤的发生、转移及预后均具有重要意义，是治疗肿瘤血管生成的重要靶向。研究发现VEGFsiRNA转染宫颈癌HeLa细胞株可使细胞中VEGFmRNA表达量降低，并且不同的siRNA下调mRNA效率不同。

3 microRNA 在宫颈癌治疗中的研究

microRNA是一类内源性非编码小RNA，长约18～21个核苷酸。可以与靶mRNA序列的3'端非翻译区碱基互补配，降解这段靶mRNA或抑制其翻译，属于转录后基因表达调控[16]。microRNA对基因的表达抑制作用已经在一些研究中得到证实，大量的microRNA的靶基因是抑癌基因或癌基因，通过调控转录后基因表达参与癌症的发生，microRNA能够识别特定目标的mRNA或抑制蛋白质翻译，在细胞癌变的过程中起到重要的作用。因此，microRNA被认为可以参与广泛的生物学功能，包括细胞凋亡与增殖、细胞分化、肿瘤的生长调控及形成等过程[17]。microRNA比较稳定，可以从细胞株中提取，也可以从各种类型的临床标本中获得，如冷冻标本，石蜡包埋组织、血液、尿液等体液中。基于以上原理，微小RNA在引起肿瘤发生的基因表达和转录调控中起重要作用，并且有望用于宫颈癌的临床诊断和治疗中。

大量研究显示，microRNA在宫颈癌的发病中起到重要的作用。miR-143和miR-145可以抑制宫颈癌细胞生长，而miR-146a对细胞增殖扩散有促进作用[18]。Li等[19]研究了与宫颈癌发生发展相关的miRNA，发现miR-29与宫颈癌的发生密切相关，它可以通过抑制细胞周期循环从而抑制癌症的发生。同时，由于YY1、CDK6与癌基因E6/E7的表达成正相关，miR-29可以通过靶向作用YY1与CDK6抑制癌基因的表达，从而抑制宫颈癌的发生。miRNA启动子的异常甲基化是某些miRNA基因与癌基因或抑癌基因功能发生改变的原因之一，有相关研究发现，miRNA基因甲基化状态的改变可以使宫颈癌中miRNA表达受到抑制作用。miRNA基因的甲基化状态可以通过甲基化PCR、亚硫酸盐修饰法或焦磷酸测序进行分析，有研究[20]以HPV感染的宫颈细胞为研究对象，发现miR-432、miR-1286、miR-641、miR-1290、miR-1287和 miR-95表达高甲基化。其他研究中也发现在高级别宫颈病变中，miR-149、miR-203和miR-375的高甲基化，同时发现miR-203和miR-375可能作为宫颈癌前病变的标志物[21]。以上研究说明，一些miRNA在宫颈癌中显示出不同的甲基化变化，并且不同miRNA的甲基化联合分析可能最适合于诊断宫颈病变的发生。

4 LncRNA 与宫颈癌的相关性研究

根据高通量基因组转录分析技术，发现人类基因组中有20 000多个基因可以编码蛋白，大约占整个基因组的2%[22]，其余的基因则被转录成或长或短的不能编码蛋白的RNA（非编码RNA）。长链非编码RNA(longnon-codingRNA，LncRNA)是一类转录本长度大于200bp的大分子RNA，其特点是不编码蛋白，但表达具有明显的组织器官特异性，广泛分布于细胞核或细胞质中。LncRNAs一般由RNA聚合酶Ⅱ转录，有时也经过剪接加工，具有帽子及polyA尾结构，但其由于缺少开放阅读框而不具有编码蛋白质的能力。近年来发现，LncRNA参与多种基因表达调控过程，包括转录调控、转录前或表观遗传学调控[23]。这些由LncRNA参与的转录调控可影响癌症或其他疾病的发生。与小非编码RNA（如miRNA）相比，LncRNA的生物学功能还远未被发现，然而一些研究发现了LncRNA的调控作用，包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞转移等[24]。肿瘤细胞中某些特定的LncRNA表达量发生变化，这些特异型LncRNA的表达情况可作为肿瘤诊断指标和治疗的分子靶点，因此推测LncRNA也将是肿瘤研究的新方向。

近年来，LncRNA与宫颈癌的发生成为研究热点之一，与宫颈癌发生相关的LncRNA也陆续被发现。Hoppe-Seyler等[25]发现仅高危型HPV感染不足以导致宫颈癌的发生，通过研究推测LncRNA可能通过改变病毒转录水平，增强致癌靶基因E6/E7表达过程，从而促进癌变发生。LncRNACRNDE是2011年发现的与结直肠肿瘤相关的基因，因其较低的编码蛋白质能力，被归类为长链非编码RNA。研究发现，LncRNACRNDE在许多癌组织或细胞中处于高表达状态，其中在宫颈癌组织中的表达量明显高于癌旁组织[26]。根据这一研究发现我们猜测，LncRNACRNDE可以为宫颈癌的诊断、治疗及预后提供理论依据，有助于进一步寻找肿瘤标志物。长链非编码RNAFAL1在多种肿瘤组织（如宫颈癌、乳腺癌等）中表达异常，并发现其具有激活原癌基因的生物学功能。Hui等[27]利用qRT-PCR技术检测细胞中FAL1基因表达水平，发现FAL1在Hela细胞中较正常人宫颈细胞中处于高表达量；将FAL1的siRNA片段转染至宫颈癌Hela细胞中，并检测其沉默效率，转染后Hela细胞中FAL1的表达量下调，Hela细胞的增殖和侵袭迁移力也受到明显抑制。该研究显示，FAL1在宫颈癌中起着癌基因的作用，可以促进宫颈癌的发生。因此，LncRNAFAL1可以作为治疗宫颈癌的又一重要的基因作用靶点，这一理论依据为研究开发新的抗肿瘤药物提供了新思路。