嗜水气单胞菌和温和气单胞菌快速PCR方法检测

张新艳

摘要 本研究根据GenBank数据库已发表的气单胞菌属16S rDNA序列，设计嗜水气单胞菌、温和气单胞菌16S rDNA序列的特异保守区，建立这2种菌的快速PCR检测方法。结果表明，仅嗜水气单胞菌和温和气单胞菌得到了特异性扩增，而几种常见弧菌科水产病原菌，包括豚鼠气单胞菌、易损气单胞菌、杀鲑气单胞菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和鳗弧菌并未得到特异性扩增，说明设计的引物可以用于这2种病原的PCR快速检测方法的建立，可以为水产动物嗜水气单胞菌、温和气单胞菌的快速检测、病害预警和病原调查提供技术支撑。

关键词 嗜水气单胞菌；温和气单胞菌；PCR；快速检测

中图分类号 Q93-337 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）22-0238-02

Abstract Based on the 16S rDNA sequence of Aeromonas hydrophila published in GenBank database，the specific conserved region of 16S rDNA sequence of Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria was designed and a rapid PCR method was established for the detection of these two bacteria.The results showed that only Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria were specifically amplified，while several common aquatic pathogens，including Aeromonas hydrophila，Aeromonas caviae，Aeromonas trota，Aeromonas salraonicida Vibrio parahaemolyticus，V. vulnificus，V.anguillarum，V. alginolyticusere were not specifically amplified. Thus the primers could be used for rapid detection of the two pathogens and provided the technical support for disease warning and pathogen investigation of Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria.

Key words Aeromonas hydrophila；Aeromonas sobria；PCR；rapid detection

气单胞菌广泛存在于淤泥、海水、淡水、土壤、污水中，代表性的有嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和温和气单胞菌（A. sobria），可引起哺乳类动物、禽类、两栖类以及鱼类的局部感染，如皮肤溃疡或败血症等[1-3]，也可以单独或与其他致病菌共同感染，是水生动物常见致病菌，其中在鱼类中最为常见，不仅给水产养殖业带来严重的经济损失，还可以通过水产动物和水产品感染人畜，导致人畜食物中毒和腹泻，引发人类急性肠胃肌肉坏死、筋膜炎、败血症等，影响食品安全，已成为人-兽-鱼共患病原菌，引起了水产界、兽医学界和医学界的高度重视[4-7]。目前，检测菌种的方法主要有Dot-ELISA、鉴别培养基、间接ELISA等[8-11]，但都存在特异性不强或操作复杂等缺点。随着PCR技术的发展，病原菌的检测又多了一种方法[12-14]。本研究以公开发表的嗜水气单胞菌、温和气单胞菌16S rDNA序列的特异保守区设计一组引物，建立这2种菌的快速PCR检测方法，旨在为水产动物嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的快速检测和病原调查提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

試验菌株（表1）在福建省淡水水产研究所保存，所有菌株皆用营养琼脂（NA）和营养肉汤（NB）（北京陆桥）进行培养、传代。

2×PCR MasterMix、DNA marker D2000为TIANGEN产品，琼脂糖为OXOID产品，其他为国产分析纯。

1.2 引物设计

根据GenBank数据库已发表的气单胞菌属16S rDNA序列设计嗜水气单胞菌、温和气单胞菌特异性引物，引物由Invitrogen公司合成，具体见表2。

1.3 细菌基因组DNA提取

从平板中直接挑取一环分离菌株细胞，接入营养肉汤培养基，在28 ℃下180 r/min振荡培养过夜，次日取1mL菌液5 000 r/min离心收集菌体，加入100 μL无菌重蒸H2O，旋涡混匀后，沸水浴2 min，以12 000 r/min离心5 min，上清液中即含细菌基因组DNA，可直接用于PCR扩增。

1.4 引物特异性扩增

采用普通PCR进行引物特异性验证，PCR反应在Epp-endorf Mastercycler Gradient PCR仪上进行，每个样品分别加入2×PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA（20～200 ng/μL）1 μL，用无菌超纯水补足反应体系至25 μL。扩增反应参数为94 ℃预变性5 min，然后在94 ℃变性1 min，57 ℃退火1 min，72℃延伸1 min，反应循环30次，72 ℃延伸10 min。PCR反应均设置不含DNA的空白对照。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳分离，用柯达凝胶成像系统记录分析。

1.5 应用

选取实验室近年来分离的气单胞菌菌株50株，分别用这2对引物进行PCR扩增，同时用ELISA方法进行检测。

2 结果与分析

2.1 嗜水气单胞菌特异性扩增

使用引物对AH-F/R1对18株常见水产病原菌进行特异性扩增，结果见图1。可以看出，仅嗜水气单胞菌菌株得到特异性扩增，扩增得到目的条带大小约680 bp，与预期相符。因此，该引物对可以用于嗜水气单胞菌的特异性分析。

2.2 温和气单胞菌特异性扩增

使用引物对AS-F/R1对18株常见水产病原菌进行特异性扩增，结果见图2。可以看出，仅温和气单胞菌菌株得到特异性扩增，扩增得到目的条带大小约680 bp，与预期相符。因此，该引物对可以用于温和气单胞菌的特异性分析。

3 结论与讨论

采用PCR方法对近年来实验室分离的菌株进行检测，嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的检测结果与采用ELISA方法进行检测的检出结果一致；同时对部分菌株进行16S rDNA测序或进行微生物质谱鉴定，结果也一致。因此，可证明所建立的方法比较可靠，可用于嗜水气单胞菌、温和气单胞菌的快速检测。

暴发性流行病的防治可通过对病原的早期诊断和长期监控等重要手段，除传统的生理生化鉴定外，有必要建立灵敏度更高、特异性更强的快速鉴定方法。与传统鉴定方法相比，PCR技术具有操作简便易行、快速、准确等优势，所以在鉴定病原菌方面得到越来越广泛的利用[15-16]。通过比较、分析已知细菌核糖体RNA（rRNA）序列，扩增其中的特异性片段来鉴别细菌被证实是行之有效的方法[17-18]。本研究通过比对GenBank中气单胞菌属16S rRNA序列，设计特异性引物试图将嗜水气单胞菌、温和气单胞菌与其他水体中常见弧菌科细菌特别是水产气单胞菌属细菌鉴别开来，研究中下游引物使用2种细菌兼有的共同序列，上游引物使用特异性的引物。结果表明，设计的2对引物能够分别很好地扩增嗜水气单胞菌和温和气单胞菌，其他试验菌株并未得到扩增，说明此引物具有很强的特异性，可以较好地应用于嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的PCR快速检测。

在细菌基因组DNA模板的处理上，本研究采用了热处理菌液后直接用于PCR扩增，大幅度缩短了试验时间，减少了中间部分操作。理论上，热处理的DNA模板为微克级，本研究PCR法扩增的灵敏度可检测的细菌数量为100 CFU/mL，完全能够满足在渔业生产中病原早期诊断、监控和暴发性流行病预警的需要。随着PCR技术的进一步发展和完善，它将成为水产动物致病菌检测的重要技术手段，为实验室诊断和流行病学调查提供较好的分析依据。

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