烟草凝集素及其类蛋白在病虫害防治中的应用研究进展

袁清华 马柱文 张景欣 索海翠 李集勤 李淑玲 何钊杰 黄立飞 张振臣 蒲小明 陈俊标 林壁润

摘要 烟草凝集素是近年来新发现的、对病虫害具有防治作用的烟草天然产物。本文从Nictaba及其类蛋白的发现过程、结构特征和生理功能等方面综述了其研究进展，分析了Nictaba在防治虫害、病毒病害、细菌病害、真菌病害、非生物胁迫中的作用以及Nictaba结构具有特异性和多样性统一的特征，阐明了该类物质结构与功能的相关关系及其应对胁迫的基本原理为今后重要的研究方向，对充分挖掘此类物质在病虫害防治中的应用潜力具有重要意义。

关键词 烟草凝集素；烟草凝集素类蛋白；抗虫性；抗病性；非生物胁迫

中图分类号 S435 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）22-0113-04

Abstract Nicotiana tabacum agglutinin（Nictaba）has been newly discovered，as a natural product for pest control in tobacco.This review summ-arized the research progress of Nictaba and Nictaba-like proteins in their discovery，structure features and physiological functions，thus illuminated their potential abilities in control of pest，viral diseases，bacterial diseases，fungal diseases and other abiotic stresses，analyzed the structure of Nictaba characterized by unity of specificity and diversity.Relationship between the protein structure and its related functions and how it cope with environmental stress should be important research directions in the future.Thus it has important significance to work out the potential abilities in the pests control and diseases prevention.

Key words Nictaba；Nictaba-like protein；insect resistance；disease resistance；abiotic stress

煙草凝集素（Nictaba，Nicotiana tabacum agglutinin）是近10年来新发现的一类来源于烟草，可防治各种病虫害的有效物质。虽然目前国内相关研究极少，但在国外却正在慢慢形成以Nictaba为载体、利用烟草天然产物进行病虫害防治的新研究方向。虽然研究刚起步，但已有研究结果表明，Nictaba及其类蛋白（烟草凝集素类蛋白，Nictaba-like protein）无论是在生物胁迫还是非生物胁迫中，均表现出强大的生物学功能，尤其在抗虫功能方面的研究较深入[1-5]。Vandenborre等[6]认为，杀虫凝集素类物质对综合害虫管理措施的发展有极大的贡献，而此类物质对非目标有机体的伤害极小。由此可见，Nictaba在病虫害防治上具有广泛的作用，是极具应用潜力的植物源防治物质。本文对近年来Nictaba在蛋白结构、生物学功能以及病虫害防治中的研究进展进行了综述。

1 Nictaba家族蛋白简介

1.1 Nictaba及其类蛋白的发现

Nictaba于2002年首次从烟草叶片中分离出来[7]。当时发现，经赤霉素（GA3）处理过的烟草叶片产生一类凝集素（Lectin），蛋白质序列分析发现，其为富含亮氨酸结构域的一种低聚半乳糖结合蛋白糖蛋白。聚糖阵列分析显示，Nic-taba也含有高甘露糖和复合N-聚糖的反应晶体结构（Man）3β1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-N-Asn。Nictaba在烟草植株中各个部位均有分布[2，4，7-8]。与植株的其他部位相比，烟草叶片中Nictaba的含量更高，然而不是所有烟草品种中都可以检测到它的存在[9]。据Van等[5]报道，除了烟草以外，其他粮食作物如大豆也发现有类Nictaba蛋白类物质的存在。

对已公开的基因组、转录组数据库进行搜索，发现Nic-taba同源序列在植物界中广泛存在，具有物种特异性（即在其他真核生物或原核生物中检测不到其直系同源物），据此提出，Nictaba是普遍存在有Nictaba结构域的Nictaba类蛋白家族的原型[1]，而不同植物物种中组成Nictaba与其类蛋白的几个氨基酸序列结构域在直系同源物之间是保守的[10]。除烟草类作物外，双子叶植物包括拟南芥（Arabidopsis tha-liana）、番茄（Solanum lycopersicum）、马铃薯（Solanum tubero-sum）、黄瓜（Cucumis sativus）、大豆（Glycine max）、芹菜（Apium graveolens）、莲藕（Lotus japonicas）和杨树（Populus tricho-carpa），单子叶植物如大麦（Hordeum vulgare）、稻谷（Oryza sativa）以及低等植物小立碗藓（Physcomitrella patens）等[1，11-12]都鉴定到含有与Nictaba蛋白同源的序列。尽管Nictaba相关蛋白分布如此广泛，但目前为止仅有其中少数部分的特性得到研究。

1.2 Nictaba家族蛋白的结构特征

最初发现的Nictaba蛋白的cDNA序列由498个单核苷酸组成，可翻译为165个氨基酸的无信号肽序列[7]。后来发现，大部分Nictaba蛋白由1个或多个结构域与非相关 N-和（或）C-末端结构域融合构成嵌合蛋白，很少有直系同源物完全由单个Nictaba域构建[1，11，13]，其他作物的Nictaba相关序列与Nictaba主序列的相似度达到40%以上[14]。这些结构域的功能或已知或尚未定义，而Nictaba的凝集素活性所需的Trp残基被包含在这些保守的模块中。Delporte等[1]根据不同结构域的排列将Nictaba相关蛋白分为单（S型）域蛋白和多（M型）域蛋白质。S型S0直系同源物仅含Nictaba结构域；基于其N-末端基序的长度变化和附加C-末端序列的有无，嵌合蛋白进一步细分为6种不同类型（S1～S6）。此外，依照S型的分类习惯，按附加的N-或C-末端基序将具有已知N-末端结构域的嵌合蛋白再分为T型（TIR-Nictaba）、A型（AIG1-Nictaba）、P型（蛋白激酶-Nictaba）和F型（F-box-Nictaba）蛋白。最后，M型的Nictaba类蛋白包括由三重Nictaba模块和具有中等长度的N末端序列构建的M1型蛋白质，以及由双Nictaba模块、具有N-末端F盒结构域和C-末端基序构建的M2型蛋白质。

目前的研究仅得到F型蛋白的部分功能信息。根据其结构域特征细分为4种类型[1]：F0型代表通过接头序列连接的仅由1个N端F-box模块和1个C末端Nictaba结构域构成的蛋白质；F1型F-box-Nictaba蛋白为带有非相关的短（<50 AA）N-末端结构域而不含C-末端序列的推定蛋白；F2型具有短N-末端结构域和C-末端的蛋白质序列；F3型具有中等长度（50～100 AA）N-终端域。目前，虽发现拟南芥中的Nictaba相关F-box蛋白序列最多编码约30个同源物，然而缺乏cDNA或EST水平的直接证据。而相应的这些同源物的氨基酸序列在F-box结构域以及Nictaba结构域中的相似度较高，分别>90%和>40%。另外，一般外显子、内含子结构都相对保守，其中第1个外显子编码F盒结构域，另外2个外显子编码Nictaba结构域。这些与功能密切相关的结构域是保守的，并存在于所有分析的序列中[10]；由于其他功能团也会发挥作用，目前不能预测F盒和Nictaba结构域发挥功能的具体方式。

1.3 Nictaba家族蛋白的生理功能

Nictaba是一种诱导型凝集素，茉莉酸直接诱导或害虫取食烟草均可激活茉莉酮酸途径而产生Nictaba[7，13，15-17]。由于这类物质具有应激诱导表达的特征，推测其在烟草植物的应激生理和防御反应中发挥内源性信号转导作用，在植物胁迫信号途径中扮演十分重要的作用。研究表明，茉莉酸（JA）及其衍生物茉莉酸甲酯（MeJA）在烟草叶片中可诱导凝集素活性。JA或MeJA处理后，枯斑三生烟（Nicotiana tabacum var.Samsun NN）的被处理叶以及未处理叶中均检测到凝集素活性，但在未处理植株的叶中未检测到凝集素活性[13]。此外，并非所有烟草属物种均对茉莉酸有反应，这表明即使紧密相关的物种也可能在专门的激素反应方面有所不同[9]。在昆虫取食后Nictaba表达上调，据此推测凝集素可能通过直接影响捕食者而在植物防御中发挥其附加功能。而用野生型烟草和过量表达或抑制表达的转基因烟草植株进行幼虫饲养试验，研究结果表明，过量表达Nictaba的烟草植株显著抑制鳞翅目幼虫的生长[18]，研究推測Nictaba的杀虫活性可能依赖于其凝集素活性和定位于昆虫中肠的糖缀合物的相互作用（例如壳多糖微原纤维）。

功能性凝集素作为核细胞质蛋白，由外界环境刺激诱导表达，具有明确特异性。目前对其进行的研究主要集中在植物细胞核、细胞质内推定的糖基化相互作用伴侣的鉴定，尤其是其在细胞核内的作用。远程蛋白质印迹分析表明，Nic-taba以糖依赖性方式结合来自BY-2细胞的多个糖基化核蛋白[14]；亲和层析和免疫共沉淀试验[19-20]以及体内相互作用研究[19]（包括共定位和分子荧光互补测定）证明，Nictaba通过其O-GlcNAc修饰与核心组蛋白相互作用并调控相关防御基因表达。基于Nictaba胁迫诱导合成、核定位以及与组蛋白相互作用的特性，研究人员提出该类蛋白通过染色质重塑和调节防御相关基因表达作用于应激信号通路的假设[19，21]。由此可见，Nictaba及其类似物的结构特点决定其功能，而其功能的表达则由外界环境刺激诱导产生。然而，至今为止，此类蛋白如何行使其生理功能尚不清楚。

2 Nictaba在病虫害防治中的应用

2.1 虫害防治

目前，关于Nictaba在抗虫功能方面的研究较深入。棉叶虫（Spodoptera littoralis）[13，17]和大豆蚜虫[22]（Aphis glycines ma-tsμmura）均可诱导烟草产生Nictaba。受棉叶虫幼虫攻击后，茉莉酸及其前体12-氧-植物二烯酸（12-oxophytodienoic acid，OPDA）和甲酯化产物的积累均与烟草叶片中Nictaba的积累成相关关系，这种积累是系统获得性的。Nictaba不但在取食处的叶片被检测到，在其他未被取食的叶片上也存在。而对茉莉酸及其前体12-氧-植物二烯酸OPDA和甲酯化产物进行羟基化和随后的硫酸化和葡糖基化则生成无活性产物并失去诱导Nictaba基因表达的能力。把从大豆中分离出来的类Nictaba基因在拟南芥中进行过量表达后，大豆蚜取食也可诱导该基因的表达，从而提高拟南芥诱导系对大豆蚜取食的耐受性。除此以外，Nictaba对烟草天蛾（Manduca sexta）幼虫亦有毒性[18]。

昆虫取食方式对烟草凝集素诱导表达有影响。不同食性节肢动物取食烟叶后，咀嚼式口器昆虫棉叶虫（Spodoptera littoralis）和刺吸式口器昆虫二斑叶螨（Tetranychus urticae Koch）均可诱导Nictaba表达，而部分刺吸式口器昆虫如蚜虫（Aphidoidea）和粉虱（Aleyrodidae）则不会导致Nictaba积累，机械损伤和昆虫分泌物处理也不能诱导Nictaba的积累，说明烟草凝集素的表达具有诱导方式和物种的特异性。

有研究发现，纯Nictaba可以抵抗鳞翅目昆虫中肠蛋白水解酶的作用[18]，并对昆虫上皮中肠细胞的生长产生抑制作用[23]。而对Nictaba进行基因沉默后，可以大大提高灰翅夜蛾[（Spodoptera mauritia（Boisduval）]幼虫的发育表现；对缺乏Nictaba基因的烟草转基因表达该基因后，作为饲料喂养美国菜蛾，可以使美国菜蛾的体重增长减缓并延迟其发育。利用无细胞表达的方法研究其纯合物的生物学功能，发现10 μg/mL的无细胞表达产物对昆虫上皮中肠细胞生长的抑制率达50%，而30 μg/mL的无细胞表达产物对昆虫上皮中肠细胞生长的抑制率达100%。共聚焦显微镜观察到Nictaba被中肠细胞吸收后主要定位在细胞质中，细胞核内检测不到标识Nictaba的荧光点。

2.2 抗病毒活性

Nictaba对烟草普通花叶病病毒（tobacco mosaic virus，TMV）具有抑制作用[24]，除此以外，对人类致病病毒（如流感病毒HIV-1、冠状病毒SARS-CoV）等亦具有广谱抗性[25-26]。

Keyaerts等[25]评估了33种植物凝集素的抗病毒活性。结果发现，以Nictaba为代表的N-乙酰葡糖胺特异性植物凝集素表现出抗冠状病毒活性：对SARS-CoV的EC50值（半最大效应浓度）为（1.7±0.3）μg/mL，在中间纳摩尔范围，CC50（50%抑制浓度）>100 μg/mL（无毒CC50为50～100 μg/mL）；对FIPV的EC50值为（4.3±1.9）μg/mL，CC50>100 μg/mL；选择性指数>59。与2种冠状病毒的EC50值有显著相关关系（r=0.70）。而关于Nictaba与HIV-1的包膜糖蛋白作用的特异性研究[26]发现，N-乙酰基-D-葡糖胺（GlcNAc）结合凝集素对流感病毒A/B、登革热病毒2型、单纯疱疹病毒属1型和2型的包膜病毒家族、HIV-1/2等均显示出广谱抗病毒（UDA）活性。Nictaba针对各种HIV-1毒株和HIV-2的IC50处于低纳摩尔水平（范围为5～30 nmol）。此外，NICTABA抑制HIV-1感染的T细胞与未感染的CD4+T淋巴细胞之间的合胞体持续形成，并阻止DC-SIGN介导的HIV-1传播到CD4 + 靶淋巴细胞。与迄今为止描述的许多其他抗病毒糖结合剂（CBA）不同，Nictaba不阻断HIV-1捕获DC-SIGN+细胞，不干扰人单克隆抗体2G12与gp120的结合且对非包膜病毒无抗病毒活性。因此，Nictaba可作为具有多效性的潜在的抗病毒备选试剂。

2.3 抗细菌活性

番茄细菌性斑点病（tomato bacterial speck）病原菌可提高拟南芥中的F-box-Nictaba基因表达量[27]。F-box-Nictaba功能凝集素蛋白质由At2g02360基因编码，兼具保守F-box结构域和结合N-乙酰基乳糖胺结构。番茄细菌性斑点病菌菌株DC3000（Pst DC3000）处理后可引起拟南芥中凝集素基因的表达[28]。过表达F-box-Nictaba基因的拟南芥植株比野生型植株和基因敲除植株表现疾病症状少，细菌定量也会减少。

过表达2种来自大豆（Glycine max）的Nictaba同源物（GmNLL1和GmNLL2）使转基因拟南芥植株比野生型植株对丁香假单胞菌pv具有更高的抗性[22]。感染后第4天会清除第3天出现的症状。拟南芥叶中丁香假单胞菌的生物量测定结果发现，感染后3 d，转基因品系中丁香假单胞菌生物量的平均比例均低于野生型植物，但仅有2个转基因品系显示统计学显著性差异；在感染后4 d，野生型和转基因植物的比例接近，只有NLL2-1系的假单胞菌生物量比野生型显著降低。可见，过量表达NLL（Nictaba-like lectin）可以提高植物针对细菌感染（丁香假单胞菌）的耐受性。

2.4 抗真菌活性

目前研究结果表明，Nictaba对真菌性病害的作用具有条件性。在感染坏死性病原体（Botrytis cinerea）的煙草叶中研究了Nictaba的诱导，并与几种节肢动物害虫进行了比较。结果表明，灰葡萄孢不会诱导Nictaba表达[17]。然而，经盐处理后，大豆疫霉病菌感染可触发特定NLL基因的表达[22]。虽然大豆中的GmNLL1和GmNLL2基因表达在大豆感染疫霉病菌后显著上调，但是在拟南芥中对GmNLL1和GmNLL2进行异位表达却不能增强植物对疫霉病的抵抗力。

2.5 非生物胁迫反应

Nictaba作为茉莉酸诱导蛋白之一，可以帮助作物更好地适应环境条件的变化。Nictaba作为茉莉酸途径中的植物激素，除可防御昆虫和病原体外，对环境中的非生物胁迫也发挥作用。12 h冷处理后，烟草植物根系中低水平表达Nic-taba，但冷处理对叶片中的凝集素表达水平无影响[29]。与对照植物相比，热应激增强F-box-Nictaba 基因表达。热应激10 h后，最大上调近3倍[27]。研究拟南芥Nictaba转基因植株对外源胁迫反应时，整个植物发育过程均可检测到的F-box-Nictaba基因的表达，在不同盐浓度的半强度MS培养基上，转基因拟南芥品系比野生型具有更高的盐耐受性[22]。

3 Nictaba在病虫害防治中的作用展望

綜上所述，Nictaba是植物应对环境胁迫、由茉莉酸诱导产生的一种植物凝集素类物质，其在植物抗生物胁迫和非生物胁迫中起广泛而重要的作用。具有Nictaba结构域的Nic-taba及Nictaba类蛋白广泛存在于烟草及一些粮食作物中。这些作物发展了一套复杂而完整的免疫系统以应对这些来自环境的胁迫因素。凝集素的糖结合特性使其能够成为识别入侵病原体的受体，作为免疫系统的一部分，以响应生物和非生物胁迫。

目前，人类对凝集素类物质还知之甚少，虽然已知其结构具有特异性和多样性相统一的特征，然而，该类物质结构与功能的相关关系、应对胁迫的基本原理仍是未知数。重要的是，凝集素类物质结构的特异性决定其糖结合活性的专一性，使其避免了对其他非靶标物种产生影响；而其多样性则决定了应对环境胁迫功能的多样性。充分挖掘Nictaba类物质在病虫害防治中的应用潜力，将为开拓利用自然资源防治病虫害及环境胁迫的道路提供一条新的思路。

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