一株耐盐乙草胺降解菌的分离、筛选及鉴定

王苑力 李海峰 符加珂 张月阳 屈建航 田海龙

摘 要：为获得更加适应自然环境的乙草胺降解菌株，以MSM基础盐培养基从常年经受乙草胺污染的农田土壤中分离乙草胺降解菌，筛选高效降解菌株，并对其进行鉴定及生长和降解特性分析。结果表明，共分离得到乙草胺降解细菌12株，通过高效液相色谱法定量检测确定菌株ACD-9的降解效率最高，3 d内对初始浓度为50·mg·L-1的乙草胺降解率可达到56.78 %；从菌落特征、生理生化特性以及16S rRNA基因序列3个方面分析，鉴定菌株ACD-9为芽孢杆菌（Bacillus sp.）；菌株ACD-9可在温度4～50 ℃、pH值4.5～10.0、NaCl质量浓度为0～150 g·L-1的条件下生长，其最适条件为46 ℃，pH值 5.0～6.0，NaCl 0～10 g·L-1。综合而言，菌株ACD-9环境耐受力较好，适应能力较强，具有良好的应用前景。

关键词：乙草胺；降解菌；芽孢杆菌；耐盐性

中图分类号：S482.4+6 文獻标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.12.022

Abstract： To obtain bacterial strains that could adapt a wide range of natural environment conditions， mineral salts medium （MSM） was used to isolate acetochlor-degrading bacteria from the soils that were subject to acetochlor contamination many years. The strain with higher acetochlor-degrading efficiency was screened and identified， and the growth and acetochlor degrading characteristics were also studied. The results showed that 12 acetochlor-degrading bacterial strains were obtained in total， in which ACD-9 was certified as the highest efficiency strain through high performance liquid chromatography （HPLC） method， and the 3rd day acetochlor degradation rate was 56.78% for 50 mg·L-1 acetochlor of in the liquid. According to the results of colony morphology， physiological and biochemical characteristics， and 16S rRNA gene sequence analyses， ACD-9 was identified as a member of Bacillus. ACD-9 could grow under the condition of 4～50 ℃， pH 4.5～10.0， and 0～150 g·L-1 NaCl， while the optimal condition was 46 ℃， pH 5.0～6.0，0～10 μg·L-1 NaCl. In conclusion， ACD-9 had good tolerance and adaptation for environment， which could be applied with a good prospect.

Key words： acetochlor； degrading bacteria； Bacillus； salt tolerance

乙草胺（acetochlor）又名禾耐斯，是一种酰胺类除草剂，主要用于一年生禾本科杂草和部分小粒种子阔叶杂草的防除[1]，是我国生产量和使用量最多的三大除草剂之一[2]。但是，由于乙草胺在水中的溶解度较大，迁移性较强，不易光解和挥发[3]，导致其降解周期较长，很容易在土壤中残留并对农作物造成药害，引起环境污染。由于大量使用乙草胺，其在很多作物或食品中已被检出，对人类的健康构成了一定威胁。此外，乙草胺还可致两栖动物肝脏、小鼠的骨髓受损以及蟾蜍胚胎畸形发育，职业性接触乙草胺对人类精液质量也有显著影响[4]。目前，乙草胺已经被美国环境保护局定为B-2类致癌物[5]。由此可见，提高环境中乙草胺的降解率，减少农田中乙草胺的残留危害，在食品安全领域具有重要的现实意义。

微生物作为农田中农药残留的主要降解者，因具有针对性强、周期短、见效快、费用小、环境代价小、可最大限度地降低农药污染物的浓度等优势，逐渐成为农药污染土壤生物修复研究的热点。目前，已报道的乙草胺降解菌主要分布于假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）、申氏杆菌属（Shinella sp.）、粘着剑菌属（Ensifer sp.）、副球菌属（Paracoccus sp.）等[3，6-9]。XU等[7]从乙草胺污染土壤中分离到的食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）LCa2菌株，对7.6 mg·L-1乙草胺的7 d降解率为98.03 %；倪俊等[3]分离得到了一株申氏杆菌（Shinella sp.），能在48 h内高效降解50 mg·L-1的乙草胺；董滨等[6]获得的粘着剑菌（Ensifer adhaerens）A-3菌株，可以乙草胺作为唯一氮源，10 d对10 mg·L-1乙草胺的降解率为33.6 %。此外，也有一些在极端环境下适应性较强的农药降解菌的报道，如熊海铮[10]从土壤中筛选到一株可耐受盐浓度为10%的芽孢杆菌（Bacillus sp.）e5菌株，2 d内对50 mg·L-1广灭灵的降解率为32%；孙雪莹[11]在寡营养条件下获得一株异养硝化菌（Stenotrophomonas sp.），能够有效降解阿特拉津；杨德玉等[12]从土壤中分离出一株莠去津降解菌SY-AD-9，耐盐极限能达到14%。但目前关于环境适应性较强的乙草胺降解菌研究报道还较少。

本研究从长期受乙草胺污染的农田土壤中分离、筛选出一株能够适应自然环境的高效降解菌株，并对其生长特征、生理生化特性等方面进行研究，旨在为修复乙草胺等酰胺类除草剂污染的土壤、水体等环境介质提供菌种资源。

1 材料和方法

1.1 材 料

土壤样品采自山西省原平市田间常年遭受乙草胺污染的玉米根际土壤。

筛选培养基为基础盐固体培养基（Mineral salts medium，MSM）：（NH4）2SO4 1 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 1 g，微量元素溶液1 mL，琼脂18 g，加蒸馏水溶解并定容至1 L，pH值7.0，121 ℃灭菌30 min。其中微量元素溶液包含MnSO4·H2O 0.13 g，ZnC12 0.23 g，CuSO4·H2O 0.03 g，CoC12·6H2O 0.42 g，NaMoO4·2H2O 0.15 g，A1C13·6H2O 0.05 g，加蒸餾水溶解并定容至1 L。

MSM液体培养基同基础盐固体培养基（不添加琼脂）。

LB培养基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加蒸馏水溶解并定容至1 L，pH值7.0，121 ℃灭菌30 min。

1.2 方 法

1.2.1 乙草胺降解菌株的富集培养 将5 g土壤样品加入到100 mL乙草胺初始浓度为50 mg·L-1的MSM液体培养基中，置于37 ℃，180 r·min-1摇床中进行富集培养，7 d后取上清液5 mL转接至新的含乙草胺的MSM液体培养基中，重复此操作3次，取1 mL上清液按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5的浓度梯度进行稀释，将稀释后的溶液分别涂布于含100 mg·L-1乙草胺的MSM固体培养基中，置于37 ℃培养箱中倒置培养。

1.2.2 高效降解菌株的复筛 用接种环挑取不同形态的单菌落于相同底物浓度的MSM固体培养基上进行划线纯化培养。连续纯化3代后，分别命名为ACD-1、ACD-2、ACD-3……，并接种于乙草胺浓度为50 mg·L-1的MSM液体培养基中培养3 d，取培养液于10 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，0.22 μm水系滤膜过滤并超声除气，利用高效液相色谱仪（Agilent 1260 infinity Ⅱ）分析培养前后样品中乙草胺含量的变化，并计算乙草胺的降解率。液相条件为流动相乙腈∶水（90∶10，V/V），分析柱为Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），紫外检测波长215 nm，流速1.0 mL·min-1，进样量20 μL，柱温30 ℃。将乙草胺降解能力较好的菌株保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2.3 菌株鉴定 将所获得的降解菌株在LB固体培养基上划线，37 ℃恒温培养3 d，得到单菌落并观察其形态；常规的生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[13]进行；细菌总DNA采用生工B518255-0100细菌基因组DNA抽提试剂盒提取。扩增引物为16S rRNA基因的通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。对16S rRNA基因进行克隆、测序与比对[14]，并利用MEGA 3.1[15]以Neighbor-joining[16]构建系统发育树。

1.2.4 高效降解菌株ACD-9的生长特性 将降解菌株ACD-9在LB液体培养基中培养至对数期，按照1 %的接种量接种于温度分别为4，15，28，37，42，46，50 ℃，pH值分别为4.5，5，6，7，8，

9，10，NaCl质量浓度分别为0，10，50，80，150 g·L-1的LB液体培养基中，每个样品设置3个重复，在37 ℃，180 r·min-1条件下培养24 h，用分光光度计检测600 nm下的OD值，研究不同条件对菌株生长的影响。

1.3 数据处理和分析

测得的数据采用Microsoft Excel 2013进行整理，使用SAS 9.1.3数据分析软件进行方差分析，并采用Turkey HSD进行多重性比较。

2 结果与分析

2.1 乙草胺降解菌株的筛选

从常年经受乙草胺污染的玉米根际土壤中筛选出能够降解乙草胺的菌株共12株，各菌株对液体培养基中乙草胺的降解情况如图1所示。其中，菌株ACD-2、ACD-9、ACD-12的降解能力较好，降解率分别为44.31%，56.78%，47.67%，显著高于其他菌株（P<0.05），三者之间亦存在显著差异（P<0.05），故最终确定菌株ACD-9作为高效乙草胺降解菌株用于后续研究。

2.2 菌株ACD-9的鉴定

综合菌株ACD-9的菌落形态、部分生理生化特性和16S rRNA基因序列的结果发现，菌株ACD-9在LB固体培养基上生长3 d后，菌落不规则、中心呈淡红色、表面干燥、并出现褶皱（如图2-a），菌体为短杆状（如图2-b），可见芽孢；甲基红试验和吲哚试验结果均为阴性，具有运动性，能产生过氧化氢酶、淀粉酶，可还原硝酸盐，利用柠檬酸盐；通过对菌株16S rRNA基因的克隆，获得1 454 bp的序列，Blast比对结果表明，其与芽孢杆菌（Bacillus sp.）的16S rRNA基因的同源性为99%，从构建的系统发育树（图3）中的位置也可判断，菌株ACD-9与芽孢杆菌属的菌株均聚在一起，所以确定菌株ACD-9为芽孢杆菌（Bacillus sp.）。

2.3 菌株ACD-9的生长特性

由图4～6可知，菌株ACD-9在温度4～50 ℃、pH值4.5～10.0、NaCl质量浓度0～150 g·L-1的条件下均能生长，表明该菌株的适应范围较广，环境耐受力较好。其中在46 ℃时菌株的OD600值显著高于其他温度（P<0.05）； pH值为5.0和6.0时菌株生长状况均显著优于其他条件（P<0.05），但5.0和6.0之间差异不显著（P>0.05）；在不同的NaCl质量浓度条件下，0～10 g·L-1菌株的生长均显著优于50，80，150 g·L-1（P<0.05），但0 g·L-1和10 g·L-1之间差异不显著。由此可见，菌株ACD-9最适生长条件是温度46 ℃，pH值5.0～6.0，盐浓度0～10 g·L-1。

3 结论与讨论

本研究从常年经受乙草胺污染的玉米根际土壤中分离筛选得到一株耐高温高盐度的乙草胺降解菌株ACD-9，经鉴定其为芽孢杆菌（Bacillus sp.），该菌株的最适生长条件为：温度46 ℃，pH值5.0～6.0，NaCl质量浓度0～10 g·L-1，在3 d内对50 mg·L-1的乙草胺降解率可达到56.78%。此外，菌株ACD-9在温度4～50 ℃、pH值4.5～10.0、NaCl质量浓度0～150 g·L-1的条件下均能生长，其环境适应性较强，可进一步丰富实际应用中乙草胺的降解和农作物药害修复研究的菌种资源。芽孢杆菌属是污染物降解中较为常见的一个属，由于产芽孢的特性，环境耐受力较好，但迄今为止对于能耐受较高温度和盐度的乙草胺降解菌的报道较少。陈森等[17]报道的乙草胺降解菌系HXDW在1%～2%盐浓度范围内均可生长，而在本研究中，菌株ACD-9在0～10 %盐浓度范围内均可生长，表明此菌株能够耐受更高的盐浓度；XU等[7]报道的乙草胺降解菌（Pseudomonas）LCa2的最适生长温度为35 ℃，而菌株ACD-9在4～50 ℃温度范围内均可生长，最适培养温度高达46 ℃，对高温的耐受力较好。因此，本研究获得的ACD-9菌株的环境适应力更强，可以考虑作为在高温地区、高盐农田等要求更多的环境中生长和发挥降解作用的候选菌种应用。

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