细胞样Western Blot分析技术探讨

汤加勇，赵 华

Western Blot(蛋白印迹法)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术,具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点,是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用方法,主要在分子生物学、生物化学、免疫遗传学等学科中时常用到。Western Blot是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色,并且通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况[1-2]。就分子生物学现状来看,现代生物科学是生物科学与众多学科之间相互交叉、渗透和相互促进的结果。如分子生物学已渗入到分子发育生物学、细胞生物学、遗传学、病毒学、饲料学、营养学等学科。学科间的相互交叉是科学研究发展的必然趋势,特别是随着分子生物学的快速发展,其将带动整个生物科学的全面发展。

Western Blot分析技术作为分子生物学中一项定性和半定量检测蛋白的常用技术,其操作技术已经很成熟[2-3],但是国内很多实验室 (特别是非专业分子生物学实验室)由于分子生物学发展和起步晚、仪器设备条件限制、人员条件限制等因素,导致很难顺利开展该分析技术。四川农业大学动物营养研究所主要从事猪、禽、草食动物和水生动物的营养需要、营养代谢与调控、饲料营养价值评定、饲料加工配制技术及交叉领域,如抗病营养、分子营养、营养与微生态学等的研究,其在分子生物学方面的研究相对薄弱。因此,本实验专门通过反复实验建立了一个适合本实验室的细胞样Western Blot分析技术,在此与广大同行进行探讨。

1 细胞蛋白样品的制备

把培养好细胞的培养板里的培养基去掉,用预冷的PBS缓冲液(pH＝7.2)洗涤细胞(按6孔培养板计,PBS添加量为2 mL/孔,其余培养板按比例添加),轻轻摇动10 s,然后弃去洗液。按以上操作再洗涤细胞一次,然后将细胞培养板置于冰上(后面的操作均在冰上进行),添加提前准备好的RIPA细胞裂解液[4-6](按6孔培养板计,裂解液添加量为每孔0.4 mL,其余培养板按比例添加),然后用枪头反复吹吸裂解液,加快细胞的裂解。待细胞裂解完全后(约2 min左右),把裂解液全部移至1.5 mL离心管中,放置于冰上。为了实验的准确性及足够的蛋白样品量,常常需要把2个(甚至更多)培养孔的裂解液移至一个离心管中。待同一批样品全部处理完后,再统一于4℃、13 000 rpm离心5 min,将上清液体按一管60μL转移到PCR管中,-80℃保存,最多可保存2个月(建议一个月内做完)。

2 上样蛋白样品的制备

将保存的蛋白样品拿一管用bicinchoninic acid(BCA)法测定总蛋白的浓度[7],为保证测定的准确性,同一样品测定孔至少为6(n＝6),此处不能用考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度[8-10]。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)每孔上样总蛋白量不低于30μg[4-6],计算每个样本的加样体积,所有样本的体积用1×RIPA裂解液来调节一致(1.5 mL离心管中),再加入蛋白loading buffer,没有样品的孔也要用1×RIPA裂解液和loading buffer按照相同的比例添加,混匀后放入沸水或100℃金属浴中10 min(一定注意不能让离心管管盖爆开),然后迅速放置于冰上10 min。待冷却后4℃、13 000 rpm离心10 min,小心吸取上清于PCR管中放置于冰上,准备上样、电泳。

3 SDS-PAGE电泳

凝胶的制备：根据目的蛋白的大小来选择合适浓度的分离胶。目的蛋白小于20 kDa选择12～15的分离胶；大于20 kDa选择10的分离胶,浓缩胶一般固定为5[4-6]。Bio-Rad品牌的垂直凝胶电泳系统中,具体分离胶、浓缩胶的浓度及加样体积如表1所示[11]。

电泳：待凝胶制备好后,取出凝胶放入电泳槽中,加入电极缓冲液,用加样器缓慢加入相同体积的制备好的蛋白液 (1 mm厚玻板的每孔最大上样量为30μL),加样过程中一定要避免气泡的产生,同时要在样品旁加预染的蛋白分子量标准,没有样品的孔添加相同体积的1×RIPA裂解液和loading buffer混合液。加好样品后,60 V电泳30 min,然后120 V电泳60 min或溴酚蓝至玻板底部。

4 半干法转膜

在SDS-PAGE电泳时,将PVDF膜裁剪好,放入倒有甲醇的120 mm玻璃培养皿中先活化15 s,然后迅速转移至1×转膜液中,同时放入Bio-Rad的转印滤纸一起浸泡至少15 min。待电泳完毕后,取出凝胶在1×电转膜液中浸泡至少15 min。然后按滤纸—PVDF膜—SDS—PAGE胶—滤纸的顺序放置好 (滤纸、PVDF膜和凝胶的大小要一致),15 V条件下根据目的蛋白大小电泳40～50 min(40 kDa左右蛋白一般电泳45 min)。

5 Western Blotting

转膜完毕后,根据预染蛋白分子量标准,用刀片切割目的蛋白条带,放入孵育盒于5的BSA(5BSA用1×TBST溶解)、80 r/min进行封闭至少1 h(一般2 h)。根据一抗效价,按居中比例加入一抗孵育液 (用5的BSA稀释),4℃孵育过夜。一抗的添加比例可根据目的蛋白的表达情况适当调整,如有磷酸化的蛋白则应先做。过夜后回收一抗孵育液 (一抗孵育液4℃放置可保存2周,至少可使用3次)[12],然后用1×TBST、80 r/min洗膜至少5 min,洗4次。根据二抗效价,按居中比例加入二抗孵育液 (用 5的BSA稀释),80 r/min、室温孵育1～2 h(一般2 h)。回收二抗孵育液 (二抗孵育液4℃放置可保存2周,至少可使用3次),然后用1×TBST、80 r/min洗膜至少5 min,洗4次。HRP化学发光液按A液 ∶B液＝1∶1的比例加好,把洗净的PVDF膜用卫生纸去掉多余的洗膜液后放入发光液体、室温、避光孵育2～3 min后用卫生纸去掉多余的发光液[3],然后放入化学发光成像仪 (Bio-Rad)成像,根据条带亮度的强弱调整曝光时间和图片张数；通过成像软件Image Lab(Bio-Rad)对图片进行相应的处理,计算出相应的蛋白表达量,即可对数据进行统计分析[1-3]。

6 膜的洗涤和再次Blotting

用1×TBST对曝光过后的PVDF膜进行洗涤(80 r/min至少5 min,至少洗4次)。洗完后加入stripping buffer、室温、80 r/min放置至少2 h；然后用1×TBST对膜进行洗涤 (80 r/min至少5 min,洗4次),最后将膜放置于1×TBST中4℃保存,准备做下一次Blotting。

7 特别需要注意的问题

1)蛋白在反复冻融情况下极易降解,于是样品裂解后一定要按照使用量对样品进行分装保存,每次使用时取一管或多管,溶解后切勿放回冰箱再次使用；

2)一抗的选择特别重要,现在市面上进口抗体假货较多,不管用国产或进口抗体如果使用多次后都做不出结果,那应该考虑更换其他公司的抗体；

3)封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液尽量不要为了节省经费而使用脱脂奶粉,最好使用5的BSA；

4)PVDF膜一旦活化后就绝对不能让其变干,否则会严重影响实验效果[13]。

8 各种试剂配方

1)RIPA裂解液的配制。

1 mL的 1×RIPA裂解液中含有 10μL的Protease inhibitor、 10 μL的 Phosphatase inhibitor 3、10μL的Na3VO4(浓度为100μmol/L)、10μL的PMSF(浓度为10 mg/mL),冰上放置,现用现配。

2)SDS-PAGE胶的配制。

SDS-PAGE胶的配制试剂及用量如表1所示。

表1 SDS-PAGE胶配方表

3)电极缓冲液的配制。

10×电极缓冲液为Trizma base 30.3 g、Glycine 144.0 g、SDS 10.0 g加dd H2O定容到1 L；使用时取10×电极缓冲液100 mL加水900 mL混匀、4℃保存即可。

4)转膜液的配制。

10×转膜液为 Trizma base 30.3 g、Glycine 144.0 g加dd H2O定容到1 L；1×转膜液为10×转膜液100 mL加700 mL的dd H2O加200 mL的甲醇,4℃保存。

5)1×TBST的配制。

10×TBS为 Tizma HCl 31.52 g、 NaCl 87.7 g加500 mL的dd H2O溶解后,调pH到7.4,然后定容到1 L； 1×TBST为100 mL的10×TBS加899 mL的dd H2O加 1 mL的 Tween 20混匀、4℃保存即可。

6)Stripping buffer的配制。

9 结束语

针对本实验室的具体情况,本文通过对细胞样品Western Blot分析操作的每个步骤进行摸索,专门建立了一个适合本实验室细胞样Western Blot的分析技术规范。本操作步骤更注重细节,比网上下载的普通步骤更详细,让WB分析更容易。本实验结果 (操作步骤和试剂配方)能很好地应用于其他实验室细胞样品的WB分析。

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