食管癌中TAZ介导食管癌上皮细胞-间充质转化的作用

朱亚宁，张 千，孙苏安，周静芳，吴 健

上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)是指上皮细胞在形态学发生向间充质细胞表型的转变，并获得迁移能力。EMT是上皮组织来源的恶性肿瘤获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程[1]。文献报道很多信号通路参与肿瘤的EMT过程，如TGF-β1等[2]，但具体机制尚不清楚。有研究显示TAZ在某些肿瘤中也参与EMT过程，如在口腔癌中TAZ不仅维持干细胞的自我更新，还促使癌由上皮细胞向间质表型转化，使口腔癌更具有侵袭性[3]。本文着重探讨TAZ在食管癌中的表达及与EMT相关指标的关系，分析TAZ在食管癌发生、发展中的作用，为食管癌的靶向治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1临床资料收集淮安市第一人民医院2010年6月～2012年1月存档的食管癌手术标本143例，每例均有相应癌旁组织。患者手术前均未接受任何放、化疗。癌旁组织定义为据肿瘤组织5 cm以上的正常食管黏膜组织。

1.2材料TAZ兔抗人多克隆抗体购自Abcam公司，EMT相关抗体、二抗及DAB试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.3方法

1.3.1免疫组化 应用免疫组化SP法检测石蜡标本，所有石蜡标本4 μm厚连续切片，65 ℃烤片2 h，脱蜡，柠檬酸盐缓冲液高温高压修复15 min，H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶10 min，一抗4 ℃孵育过夜；二抗及DAB显色按试剂盒说明书进行操作，苏木精复染，盐酸乙醇分化，稀氨水返蓝，透明，中性树胶封固。用各抗体已知阳性表达的组织作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.3.2结果判定 由两位病理医师采用双盲法阅片，每张切片随机选取5个高倍视野，每高倍视野计数100个细胞，根据免疫组化染色情况进行综合评分。TAZ蛋白阳性定位于细胞核和胞质，按阳性细胞染色强度计分[4-9]：不着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；按阳性细胞所占比例计分：≤10%为0分，11%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。将两项得分结果相乘：0～4分为阴性，5～12分为阳性。E-cadherin阳性定位于胞质和胞膜，CK阳性定位于胞质，vimentin定位于胞质，三者分别根据阳性细胞占细胞总数比例，<25%为阴性，≥25%为阳性。

1.4统计学处理应用SPSS 19.0软件进行数据分析，率和组间比较采用χ2检验和Fisher精确法。相关性分析采用Spearman相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1TAZ与EMT相关蛋白在不同食管组织中的表达143例食管癌及癌旁组织中TAZ蛋白和vimentin蛋白在食管癌组织中的阳性率(68.2%、15.4%)高于癌旁组织(19.6%、4.8%)，而E-cadherin蛋白和CKpan蛋白在食管癌组织中的阳性率(75.5%、86%)均低于癌旁组织(均为100%)，差异均有统计学意义(表1，图1～8)。

2.2TAZ、E-cadherin表达与食管癌临床病理特征的关系TAZ蛋白表达与食管癌分化程度和肿瘤分期具有相关性。TAZ蛋白在低分化食管癌中的表达明显高于中+高分化食管癌组织(P=0.026)，在Ⅲ+Ⅳ期食管癌中的表达明显高于Ⅰ+Ⅱ期食管癌(P=0.011)。E-cadherin蛋白的表达与食管癌肿瘤分期和淋巴结转移具有显著的相关性。E-cadherin蛋白在Ⅰ+Ⅱ期食管癌中的表达明显高于Ⅲ+Ⅳ期食管癌组织(P<0.001)，在不伴淋巴结转移的食管癌中的表达明显高于伴淋巴结转移的食管癌组织(P<0.001，表2)。

2.3食管癌组织中TAZ与E-cadherin、CKpan、vimentin表达的相关性Spearman相关性分析显示：143例食管癌中CKpan与E-cadherin蛋白均阳性者98例，均阴性者10例，两者表达呈正相关(rs=0.239，P=0.004)，E-cadherin与vimentin蛋白均阳性者10例，均阴性者22例，两者表达呈负相关(rs=-0.326，P<0.001，表3)，差异均具有统计学意义。TAZ与E-cadherin蛋白均阳性者58例，均阴性者9例，两者表达呈负相关(rs=-0.180，P=0.032)，TAZ与CKpan蛋白均阳性者67例，均阴性者3例，两者表达呈负相关(rs=-0.215，P=0.01，表4)，TAZ与vimentin蛋白均阳性者18例，均阴性者55例，两者表达呈正相关(rs=0.200，P=0.017，表4)。

表1 TAZ与EMT相关蛋白在不同食管组织中的表达

表2 TAZ、E-cadherin表达与食管癌临床病理特征的关系

①②③④⑤⑥⑦⑧图1 TAZ在癌旁组织中有少量表达,SP法图2 TAZ在食管癌中呈阳性,SP法图3 E-cadherin在癌旁组织中呈阴性,SP法 图4 E-cadherin在食管癌组织中呈阳性,SP法 图5 CKpan在癌旁组织中呈阳性,SP法 图6 CKpan在食管癌组织中高表达,SP法 图7 vimentin在癌旁组织中呈阴性,SP法 图8 vim-entin在食管癌组织中有极少量表达,SP法

表3 食管癌组织中E-cadherin、CKpan、vimentin表达的相关性

表4 食管癌组织中TAZ与E-cadherin、CKpan、vimentin表达的相关性

3 讨论

中国是全球范围内食管癌的高发区，欧美国家的食管癌则以腺癌为主，而中国的食管癌以鳞状细胞癌为主，两者的发生机制存在差异[5-6]。因此食管癌没有像其他恶性肿瘤一样在世界各国的广泛研究下，驱动基因及靶向药物迅速被发现。食管鳞状细胞癌的研究主要依赖包括中国在内的一些亚洲国家，发展相对缓慢，至今未发现特异的驱动基因及靶向药物。导致中国食管癌患者的预后在过去的几十年，并未随医疗条件和卫生水平的提高而得到大幅的改善。

Hippo信号通路作为肿瘤抑制信号通路，最早发现于果蝇，它可以通过调控细胞的增殖来精确地控制器官的大小[7]。在哺乳动物，Hippo通路的调节功能得到进一步发挥。其组成控件包括MST1/2、Last1/2和Mob1等；而TAZ则是这条通路中关键的转录调控因子。TAZ是具有PDZ结构域的致瘤因子[8]，它的异常表达与结直肠癌等多种肿瘤有关[9]。正常情况下，当Hippo通路活化时，TAZ被磷酸化，潴留于细胞质中，最终被降解。TAZ过表达时，过多未被磷酸化的TAZ进入细胞核，特异性地结合一系列的转录因子，如TEAD、TTF-1、Pax-8、Pax-5、TBX5等[10]，从而促进细胞的增生，抑制凋亡，导致肿瘤的发生。此外，TAZ的功能与心脏、肌肉、骨骼、脂肪等组织的发育密切相关。近年有研究显示TAZ可以调节间充质干细胞的分化，降低细胞间的黏附性，促进EMT[11]。

本组免疫组化结果表明，TAZ蛋白在食管癌组织中的表达高于癌旁组织，且食管癌与癌旁组织中EMT相关因子(表皮相关因子E-cadherin、CKpan和间质相关因子vimentin)的表达差异均有显著性，且与E-cadherin、CKpan的表达呈正相关，与vimentin表达呈负相关，E-cadherin阴性患者肿瘤分期较晚(以Ⅲ+Ⅳ为主)，更易发生淋巴结转移。表明食管癌组织中存在EMT现象，EMT可能促进食管癌的进展。TAZ阳性患者肿瘤分化程度较低，分期较晚，并且TAZ的表达与E-cadherin的表达呈负相关，与vimentin的表达呈正相关，TAZ阳性患者肿瘤分期较晚，表明TAZ可能也参与食管癌的EMT过程，使食管癌更易发生侵袭。据文献报道，TAZ可促进EMT转化，使肿瘤更具侵袭性。EMT的过程也是肿瘤由上皮表型向间质表型转化，本实验结果提示食管癌中TAZ和EMT相关蛋白的表达具有一定的相关性，其中可能存在某些共同的通路，具体机制还有待于更深入的分析。

本实验采用免疫组化SP法，检测143例食管癌及相应癌旁组织中TAZ蛋白、EMT相关蛋白表达，结果显示食管癌组织中TAZ蛋白高表达。TAZ蛋白的表达与患者分期晚有关，且与EMT相关蛋白的表达有一定的相关性，表明TAZ可能参与食管癌的EMT过程，共同促进食管癌的发展、侵袭。

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