对虾microRNA的最新研究进展❋

郭华荣， 王 玉， 左建伟， 陈月如

(1.中国海洋大学海洋生命学院海洋生物遗传与育种教育部重点实验室，山东 青岛 266003；2.中国海洋大学海洋生物进化与多样性研究所，山东 青岛 266003)

miRNA(microRNA)是一类广泛存在的长度约为18～25 nt的单链非编码小RNA，是由具有长约70～90 bp的发夹结构前体加工而来，具有5’端磷酸基和3’端羟基。miRNA的编码基因常以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中。miRNA在转录后水平通过降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻译来调控靶基因的表达，在生物的生长、发育、代谢和免疫等多种生命活动中发挥重要作用[1-2]。自第一个miRNA：lin-4从线虫(Caenorhabditiselegans)中被发现以来[3]，已有大量miRNA从各种模式生物和非模式生物中陆续被报道出来，并且miRNA的生物学发生、特征、保守性、作用机制以及生物学功能等也逐渐被人们所阐明。对虾是我国重要的水产养殖经济品种，其miRNA的研究起步较晚，始于2011年，但近6年来取得了突飞猛进的进展。本文综述了对虾miRNA的发现与鉴定、作用机制及其生物学功能方面的研究概况，旨在为对虾miRNA的研究提供参考。

1 对虾miRNA的发现与鉴定

对虾miRNA的发现主要是通过分子克隆和高通量测序2种方法，而miRNA的鉴定主要有miRNA芯片、荧光实时定量PCR和Northernblot等方法。Ruan等[4]首次从日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)成体血细胞的总RNA中，分离构建了长度为18～28 nt小RNA文库，并通过荧光实时定量PCR技术和Northernblot技术鉴定得到了35个miRNA，并且发现其中22个miRNA与对虾白斑综合症病毒(WSSV)的感染相关。此后，虾类miRNA的发现则主要采用高通量测序和生物信息学分析的方法。汪元梅[5]运用了高通量测序技术从凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)中发现了355个已知miRNA和32个新miRNA，并结合miRNA芯片、实时荧光定量PCR和Northernblot，分析了这些miRNA在凡纳滨对虾不同组织中的表达谱，以及饲料中添加复合多糖对miRNA表达量的影响。Xi等[6]对凡纳滨对虾肌肉、鳃和肝胰腺的混合样本进行了小RNA的高通量测序，共获得了239个已知miRNA和20个新miRNA。Zhou等[7]又从深海热液喷口虾(Rimicarisexoculata)的肌肉组织中发现了159个已知 miRNA和34个新miRNA。此外，Sun等[8]报道了日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)miRNA在低氧条件下的表达谱变化，共发现了203个已知miRNA和64个新miRNA，并分析了低氧条件下特异表达的miRNA。

目前，高通量测序结合荧光实时定量PCR和Northern blot验证是发现与鉴定虾类miRNA的主要方法，越来越多的研究通过此法获得对虾miRNA信息，对虾的miRNA数据库在不断地被充实，这将为对虾miRNA的生物学功能和作用机制等方面的研究奠定基础。

2 对虾miRNA的生物合成与加工成熟及其作用机制

动物miRNA的生物合成与加工成熟依次经历了以下几步：首先，编码 miRNA 的基因由 RNA 聚合酶 II 转录生成具有发夹结构的pri-miRNA；随后，RNA酶III-Drosha酶从pri-miRNA的发夹结构的茎部，通过不对称剪切，形成60～70 nt的pre-miRNA，形成的pre-miRNA在其5’端有磷酸基团，在 3’端有两个核苷酸的突出。pre-miRNA 前体能形成典型的茎环二级结构，该结构含有不完美配对的 dsRNA 区(茎部)，该区域通过剪切，最终形成一个或多个miRNA成熟体。接着，运输蛋白 Exportin-5在Ran-GTP的帮助下将pre-miRNA从细胞核中转运到细胞质中。pre-miRNA 的典型的茎环二级结构、磷酸基团和两个核苷酸的突出，对于Exportin-5与pre-miRNA的相互作用以及pre-miRNA的顺利转运都很重要。之后，细胞质中的pre-miRNA又被另一种RNA酶III-Dicer酶进一步地加工成熟。Dicer酶的PAZ结构域能识别pre-miRNA茎环的茎部3’端突出的两个核苷酸，并剪切去掉单链的凸环，加工释放一个长度为22 nt的成熟双链RNA，此RNA具有5’端磷酸基团和3’端两个突出的核苷酸。随后，其中的一条链参与构成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，从而调控靶基因的表达，这条链就是成熟的miRNA，而另一条链就是miRNA*[1, 9-10]。

在miRNA的加工成熟过程中Drosha酶是一个必不可少的组份，对虾Drosha酶在基因克隆、序列结构和功能方面的研究已有报道。徐丹丹[11]从对虾中克隆得到了Drosha基因，并发现对虾Drosha蛋白与果蝇(D.Melanogaster)的Drosha蛋白有很高的同源性，具有保守的RNaseIII与dsRBD结构域，在对虾各组织中均有表达。Huang等[12]也克隆得到了日本囊对虾中的Drosha基因，分析了其结构和功能，并且发现了它的作用之一是直接影响对虾miRNA的加工成熟过程。RNA聚合酶III Dicer酶也是RNAi通路中的一个关键组份，虾中的Dicer酶基因也已被成功克隆出来，其表达和生物学功能也有了研究报道。Su等[13]从斑节对虾中克隆出了Dicer-1基因。Yao等[14]也从凡纳滨对虾中成功克隆了Dicer-1基因的cDNA全长，并且发现Dicer-1基因与其他物种中的Dicer-1基因具有保守性，与斑节对虾中的Dicer-1基因相似性最高，达97.7%，并且Dicer-1基因在对虾的各个组织中也均有表达。后来又有一些研究，分别从凡纳滨对虾[15]、日本囊对虾和斑节对虾[16]中克隆出了Dicer-2基因，并发现它们之间也具有较高的序列相似性。对虾中的Dicer-1酶与miRNA的加工有关，而Dicer-2酶则与长的双链RNA加工成siRNA有关；此外，Dicer-1和Dicer-2也都与对虾响应病毒感染有关。miRNA要发挥其生物学功能，必须参与构成诱导沉默复合物(RISC)，而Argonaute-2蛋白是该复合物的重要组份。凡纳滨对虾[15]、日本囊对虾和斑节对虾[17]中的Argonaute-2基因也已被成功克隆，并且研究发现，它们之间也具有较高的序列相似性。此外，有研究结果显示，Argonaute-2蛋白在对虾中也参与RNAi过程[17]。由于miRNA的加工成熟过程所需要的核心组份具有物种间的高度保守性，因而可以预见的是，对虾miRNA的生物合成和加工成熟机制也具有一定的保守性。

miRNA可以通过与靶基因的mRNA的3’UTR(非翻译区)序列互补配对，介导靶基因mRNA的降解(完全的互补配对)或者翻译抑制(不完全的互补配对)来调控靶基因的表达[1]。这是较早发现的比较经典的miRNA调控靶基因的模型。后来的研究又发现，miRNA可以和编码区以及5’UTR区结合；可调控某些非编码基因的表达；miRNA甚至能够上调靶基因的表达；miRNA还可以通过解除对靶基因的抑制来促进其翻译等[18]。

3 对虾miRNA的生物学功能

目前关于对虾miRNA的生物学功能方面的研究主要集中在对虾与病毒感染和先天性免疫相关miRNA的研究两个方面。其中，有3篇报道致力于挖掘对虾中与病毒感染相关的miRNA。Zeng等[19]、Huang等[20]和Kaewkascholkul等[21]分别从凡纳滨对虾、日本囊对虾和斑节对虾(Penaeusmonodon)中发现了一系列响应WSSV感染的对虾miRNA。有5篇报道则深入研究了对虾特定miRNA在响应病毒感染过程中所发挥的作用及其作用机制。Huang等[22]发现日本囊对虾miR-7通过靶向作用于WSSV早期基因，从而在宿主-病毒相互作用中发挥重要功能。Xu等[23]发现了凡纳滨对虾中的Dorsal/miR-1959/Cactus反馈调节环路能促进WSSV的感染，其中，Dorsal蛋白是NF-kB家族成员，Cactus是Dorsal的一个胞质抑制剂。Zuo等[24]也报道了凡纳滨对虾中的miR-1959 所介导的NF-kB通路的反馈调节环路，并认为此环路与病原生物感染和免疫刺激相关。 Huang等[25]发现罗氏沼虾(M.rosenbergii)的miR-9041和miR-9850通过调控STAT(Signal transducer and activator of transcription，STAT)基因，从而促进WSSV在宿主中的复制。Shu等[26]发现对虾miR-965通过靶向作用于病毒的wsv240基因，来抑制病毒对对虾的感染。此外，他发现对虾miR-965还能够靶向作用于对虾的ATG5基因，从而促进对虾对病毒的吞噬作用。另外，还有6篇报道关注于对虾的先天性免疫相关miRNA。Liu等[27]报道了日本囊对虾miR-1所介导的对吞噬过程的调节作用。Yang等[28]发现并验证了日本囊对虾中与吞噬、凋亡或体液免疫系统相关的24个miRNA。Yang等[29]指出对虾miR-100通过调控胰蛋白酶基因来调控细胞的凋亡，从而促进对虾的抗病毒能力。Xu等[30]阐释了对虾对病毒感染的细胞免疫反应。Gong等[31]报道了miR-1000-p53通路在调控对虾细胞凋亡以响应病毒感染中的作用。He等[32]指出对虾中的两个miRNA(miR-71和miR-13b)与病毒感染以及宿主的自噬作用有重要的关系。

此外，Huang等[12]还报道了miRNA加工成熟过程中的一个重要组分—Drosha酶在对虾抗病毒感染中的重要作用，Labreuche等[33]解析了RNAi机器(RNAi machinery)在对虾抗病毒中的功能。Su等[13]和Yao等[14]指出对虾的Dicer-1酶也与对虾的免疫反应有关。Chen等[15]、Li等[16]和Yang等[17]则分别揭示了对虾Dicer2酶和Argonaute2蛋白在对虾免疫反应中的作用。这些报道对人们深入了解对虾病毒感染机制起到了极大的促进作用。

了解对虾病毒自身的miRNA在其对抗宿主免疫反应中的作用，可以更清楚地阐明对虾病毒感染机制。He等[34]研究发现，在宿主体内，病毒的miRNA能通过靶向作用于自身的基因来提高其对对虾的感染能力。Huang等[35]则发现了病毒miRNA可参与调控对虾血淋巴细胞的凋亡过程。Ren等[36]报道了在WSSV感染日本囊对虾时，WSSV中的2个miRNA(WSSV-miR-N13和WSSV-miR-N23)通过靶向作用于Toll通路中的核心基因Dorsal，来抑制对虾中的Spz-Toll-Dorsal-ALF信号通路，从而促进病毒的感染。

当然，也有少量报道是关于对虾miRNA的其它生物学功能的，例如：季鹏飞[37]报道了克氏原螯虾(Procambarusclarkii)中响应盐胁迫条件的miRNA；Ikeda等[38]则揭示了有“活化石”之称的蝌蚪虾(Triopscancriformis)中miRNA的进化，同时阐述了其RNAi机器的各组分。随着研究的不断深入，相信越来越多的对虾miRNA的生物学功能将会被人们所发现和关注。

4 展望

对虾miRNA的研究起步较晚，始于2011年，虽然已在发现对虾中与病毒感染和自身免疫相关的miRNA方面取得了重要的研究进展，但尚有许多研究工作有待于进一步开展，主要包括：(1)新的对虾miRNA及其靶基因的挖掘。目前报道的对虾miRNA的数量仍比较少，况且miRNA的表达具有组织特异性和发育阶段的特异性。因此，发现新的miRNA有利于我们深入理解对虾的多种生物学过程。但是，由于目前对虾的全基因组序列尚未公布，序列信息已知的基因其数量非常有限，大大限制了对对虾miRNA的靶基因的挖掘。一旦对虾的全基因组序列的测序和注释工作完成，将有效推动对虾miRNA的生物学功能及其作用机制的研究进展。(2)对虾miRNA的其它生物学功能尚有待进一步地探索。目前，对虾miRNA生物学功能方面的研究的主要关注点是病毒感染对虾和对虾的先天性免疫反应过程。然而，这些研究目前大多停留在相关miRNA的发现，以及初步揭示这些miRNA与相应生命活动之间的相关性这一层面上。因此，病毒感染对虾的机理以及对虾响应病毒感染所引发的先天性免疫反应的分子机制仍有待于进一步阐明。此外，对虾miRNA所具有的其他生物学功能目前报道的仍非常少，因此，发现对虾miRNA的其它生物学功能，尤其是在调控发育方面的功能及其作用机制可能成为今后研究的新方向。

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