壳聚糖复合材料在骨修复领域的研究进展

陆 遥，尹庆水，夏 虹

壳聚糖是一种天然高分子聚合物，具有良好的生物相容性和生物活性，但存在力学性能较差的缺点，在骨修复应用中受到了限制。针对这一缺陷，人们开始研发和制备壳聚糖复合材料，提高力学性能，相关研究亦显示其在骨修复领域具有良好的应用价值和广阔的应用前景[1-4]。本文就壳聚糖复合材料在骨修复方面的研究进展作一综述。

1 壳聚糖的性质和优点

壳聚糖又称脱乙酰甲壳素，是甲壳素脱乙酰化后得到的天然多糖，由随机分布的β-1，4-葡糖胺和N-乙酰-葡糖胺组成。甲壳素广泛存在于甲壳类动物（主要是虾蟹）、昆虫、真菌等生物中，是自然界储量仅次于纤维素的天然多糖；但由于结构复杂，不溶于水，萃取难度高，甲壳素的研究和应用受到严重限制。壳聚糖是甲壳素最主要的衍生物，目前主要由化学法或生物法（酶或发酵）脱乙酰化获得[5]。

除了具有良好的生物相容性和生物降解性之外，壳聚糖还具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种生物活性[6-7]。其抗菌作用主要与分子量相关，低分子量壳聚糖可穿透细菌细胞膜与DNA结合，抑制DNA转录和mRNA合成；高分子量壳聚糖则可结合到细菌细胞膜负电物质上，改变膜通透性并阻断养分运输[8]。壳聚糖还可增加白介素（interleukin，IL）1和2分泌，促进T淋巴细胞成熟和浸润，起到抗肿瘤作用[9]，并可直接诱导肿瘤细胞凋亡[10]。壳聚糖的抗氧化机制可能是其吡喃糖环上的氨基、羟基与不稳定自由基发生反应，进而形成稳定的自由基[11]。

目前壳聚糖已广泛应用于医学及生物材料研究领域，但由于力学性能较差、脆性大、溶胀率较大，单纯使用壳聚糖难以满足作为骨修复材料的要求，因此，人们将壳聚糖与天然聚合物、生物活性陶瓷、人工合成聚合物、微纳米材料等复合，借以提高其生物力学性能和成骨性能。

2 壳聚糖与天然聚合物复合在骨修复领域的应用

壳聚糖是迄今发现唯一表面带有正电荷的天然多糖，其他天然聚合物在酸性环境中多为中性或负电，这一特性使得壳聚糖能够与其他带负电荷的天然聚合物形成静电复合物，其中以壳聚糖-藻酸盐复合材料最具代表性。

2.1 壳聚糖藻酸盐复合材料

藻酸盐是一种广泛存在于藻类等生物体内的天然多糖，具有良好的生物相容性、可降解性和低免疫原性[12]。与单纯壳聚糖支架相比，壳聚糖/藻酸盐复合支架力学强度增高，利于成骨细胞黏附、增殖和分化，在体内具有更加优异的组织相容性和骨诱导能力[13]。

为进一步增强该复合材料的成骨作用，人们加入生长因子或药物等具有成骨诱导作用的物质。Florczyk等[14]分别将间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、骨髓抽吸物及骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）与壳聚糖/藻酸盐支架复合，结果表明，复合支架可有效修复大鼠颅骨缺损，其中BMP-2复合支架的修复效果最佳。Soran等[15]将载有BMP-6的藻酸盐微球与壳聚糖支架复合，显著促进了MSCs的成骨分化和矿化。Lu等[16]利用纳米铜在溶液中缓释铜离子的特性，制备了含铜羧甲基壳聚糖/海藻酸钠支架，该支架具有促进前成骨细胞MC3T3-E1黏附和成骨分化的作用，植入体内后显著促进血管化新骨生成；由于铜离子具有很强的抗菌作用，该支架在体内能够有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，可用于修复感染性骨缺损。综上所述，壳聚糖/藻酸盐复合支架在成骨、抗菌和血管生成方面均起到积极作用，无论是对于创伤性还是感染性骨缺损，都有良好的应用价值。

剂型方面，Park等[17]制备复合 MSCs、BMP-2的可注射壳聚糖/藻酸盐凝胶，注射于裸鼠皮下12周后可生成具有骨小梁结构的新生骨组织；Wang等[18]研制RGD多肽（精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸）接枝的氧化海藻酸钠/琥珀酰壳聚糖水凝胶，低能量脉冲超声刺激下可显著促进MSCs的增殖，定向诱导下则可促进MSCs的成骨分化或血管内皮分化，有助于血管化新骨形成。壳聚糖和藻酸盐复合后还可制成微球，该微球可装载成骨细胞，用于骨缺损的修复。有学者将制备的壳聚糖/藻酸盐微球包封前成骨细胞后混入可注射骨水泥中，注射于裸鼠皮下，细胞示踪结果显示前成骨细胞在体内2周时仍清晰可见，4周、8周后分别可观察到层状骨样矿化和类骨质结构[19]。总之，壳聚糖/藻酸盐在剂型上具有灵活可塑性和多样性的特点，可根据实际需要制备成凝胶、微球、支架、复合骨水泥等相应剂型，提高了骨修复效率。

2.2 壳聚糖/其他天然聚合物复合材料

Wang等[20]制备具有气泡样结构的多孔羟乙基壳聚糖/纤维素水凝胶，对前成骨细胞的黏附和增殖具有促进作用；Tong等[21]制备载有血管内皮生 长 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的壳聚糖/丝素蛋白支架，可显著提高人胚胎成骨细胞的增殖能力和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表达水平；Yin 等[22]将载有BMP2及纤维生长因子2（fibroblast growth factor-2，FGF-2）的微球加入壳聚糖/胶原支架中，结果证实该支架明显促进了骨膜衍生细胞（periosteum derived cells，PDCs）的成骨分化，进而加速了大鼠颅骨缺损的修复进程。亦有学者将壳聚糖与淀粉[23]、褐藻糖胶[24]等天然聚合物复合，观察其作为骨修复材料的可行性，从而为寻找骨缺损治疗新方法提供实验基础。

3 壳聚糖与生物活性陶瓷复合在骨修复领域的应用

天然骨组织主要由有机物和无机物构成，壳聚糖与无机物复合可以模拟天然骨组织的特征，是很有临床应用潜力的骨修复材料。

3.1 壳聚糖羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）复合材料

羟基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]是最稳定的钙磷复合物之一，也是天然骨骼的主要成分（占60%～65%）。壳聚糖与HA结合后可提高材料的力学性能和成骨性能。Zhang等[25]制备不同HA含量的壳聚糖/HA支架，结果显示，成骨细胞黏附、ALP活性、压缩强度随HA含量的增加而显著提高。

3.1.1 复合材料活性的影响因素 复合材料的制备方法、大小形状等因素均会对其生物活性产生影响。目前制备壳聚糖/HA复合材料的方法较多，常见的有物理搅拌法和原位沉积法。Chen等[26]的研究结果表明，无论是生物活性（MSCs增殖和ALP活性）还是压缩强度，原位沉积法制备的壳聚糖/HA支架都优于物理搅拌法制备的支架。

HA的尺寸和形状也会影响材料的成骨作用。Lee等[27]比较壳聚糖/微米和壳聚糖/纳米HA支架的体内骨诱导能力，结果显示后者新生骨骨体积、骨表面积、骨小梁厚度、骨小梁数量等指标均优于前者。Ji等[28]分别基于球状和棒状纳米HA制备HA/壳聚糖/明胶支架，体外实验发现，人诱导多能干细胞在接种球状纳米HA制备的支架上增殖更快，成骨基因ALP、Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的表达水平也更高；体内实验也证实前种支架植入12周后可诱导大块新生骨形成，而后种支架只有少量新骨生成。

3.1.2 复合材料的功能 除可作为细胞支架材料，为细胞黏附、生长和增殖提供良好的三维生长环境之外，壳聚糖/HA支架还可作为药物载体，为肿瘤性和感染性骨缺损的修复提供新的治疗思路。Lu等[29]采用原位沉积法制备载唑来膦酸/壳聚糖/纳米HA支架，通过调整唑来膦酸的浓度来诱导骨巨细胞瘤凋亡，支架的生物安全性和成骨诱导性均良好；Zhang等[30]将载万古霉素的介孔HA/壳聚糖复合支架植入含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的兔肌袋中，发现局部万古霉素有效抑菌浓度可持续4周，细菌增殖被显著抑制；Sa等[31]研发一种含壳聚糖/甘油磷酸酯/nHA/庆大霉素的可注射骨水泥，结果提示，壳聚糖和活性材料的加入在不影响骨水泥力学性能的前提下增强了骨水泥的矿化能力和抗菌能力。

3.1.3 复合材料的形貌 天然骨组织具有三维多孔结构，多孔支架模拟了天然骨结构，适合骨细胞黏附、生长和增殖，是一种理想的骨修复材料。除了多孔支架之外，研究者还制备其他形貌的壳聚糖/HA骨缺损复合材料。Jiang等[32]制备壳聚糖/羧甲基纤维素/纳米HA多孔薄膜，卷曲形成螺旋圆柱支架以模仿天然骨形态，植入新西兰大白兔桡骨缺损处12周后可成功修复骨缺损；He等[33]制备一种可弯曲的甲壳素/HA薄膜，该薄膜可促进前成骨细胞的黏附、增殖和成骨分化，体内实验证实其具有良好的组织相容性和一定的降解性。

3.2 壳聚糖生物玻璃复合材料

生物玻璃是另一种广泛应用的陶瓷材料，具有良好的生物安全性和生物活性。Yang等[34]在壳聚糖支架表面修饰生物玻璃，其力学性能较纯壳聚糖支架明显提升，压缩强度为（7.68±0.38）MPa，弹性模量为（0.46±0.02）GPa，与松质骨力学强度相似。Khoshakhlagh等[35]制备可注射壳聚糖/生物玻璃复合物，体外实验发现生物玻璃含量的增加可促进成骨细胞增殖；大鼠脊柱融合模型实验结果还证实，提高生物玻璃的含量可增强材料的骨诱导性。

此外，还有壳聚糖与磷酸钙、硫酸钙复合用于骨修复领域的研究[36-37]，这些复合材料具有良好的材料表征、生物安全性和骨诱导性，具备作为骨修复材料的潜力。

4 壳聚糖与人工合成聚合物复合在骨修复领域的应用

人工合成聚合物材料，如聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚 醚 醚 酮（polyetheretherketone，PEEK）、聚己内酯（polycaprolactone，PCL）、聚磷腈（polyphosphazene，PPZ）等，除了生物安全性良好之外，还具有降解率和机械强度可控，可制备形状复杂的结构，批量生产成本低、效率高等优点。但此类材料缺乏生物活性，仅有骨传导功能，因此人们将壳聚糖与之复合，通过多种途径，既提高支架的矿化和骨诱导能力，又增强人工聚合材料的生物活性，使其更适用于修复骨缺损。

Wang等[38]制备纳米HA/壳聚糖/聚乳酸羟基乙酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）支架，其压缩模量和拉伸模量较PLGA、壳聚糖/PLGA、纳米HA/PLGA支架增强；该支架可促进人脐带MSCs黏附和增殖，ALP和OCN表达水平亦显著提高；体内实验还表明，该支架载人脐带间充质干细胞植入裸鼠皮下后成骨诱导效果最佳。亦有学者将聚吡咯、藻酸盐与壳聚糖混合，冻干制成的支架生物安全性良好，具有电刺激性，体外矿化效果较纯壳聚糖支架显著提高[39]。

为进一步增强活性，Rogina等[40]采用3D打印技术制备孔径为（960±50）μm的PLA多孔支架，借助冷冻凝胶技术在支架表面形成多孔壳聚糖-HA凝胶，表面改性后的支架压缩强度和弹性模量较纯PLA支架稍下降，与人MSCs共培养后细胞量、OCN和骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）表达均显著升高，提示该支架成骨诱导能力更佳，适合骨修复。

5 壳聚糖与其他材料复合在骨修复领域的应用

研究者们将微纳米材料与壳聚糖复合来提高材料性能。Sowjanya等[41]制备壳聚糖/藻酸盐/纳米二氧化硅（nSiO2）支架，结果显示该支架的压缩强度较壳聚糖/藻酸盐支架下降，弹性模量无明显差异，但材料的蛋白吸附能力和体外矿化能力显著提高，有利于成骨。Fonseca-García等[42]制备壳聚糖/多壁碳纳米管/纳米HA支架，该支架对MSCs无明显毒性，细胞接种后可维持CD90+CD73+CD166+的干细胞表型，保持了良好的成骨分化潜能。

Ruan等[43]将氧化石墨烯（约1 μm宽、1.5 nm高）和羧甲基壳聚糖通过共价交联制成支架，其弹性模量和硬度分别较纯羧甲基壳聚糖支架提高2.75倍和3.51倍；将支架与人脂肪干细胞共培养后，细胞OPN、BSP、成骨细胞特异性转录因子Osterix、OCN和ALP的表达水平均显著升高；体内实验亦显示该支架具有优异的骨修复效果。

6 小结与展望

作为一种天然多糖，壳聚糖本身具有良好的生物相容性和抗菌活性，通过多种手段与聚合物（天然聚合物和人工聚合物）、HA、生物玻璃、微纳米材料等复合后，可形成支架、微球、水凝胶、薄膜等多种形式的材料，用于不同类型的骨缺损修复。在此基础上，壳聚糖还可作为生物活性因子和药物的载体，复合后成骨能力进一步增强，同时具有抗菌、抗肿瘤等功能，对于各种病因造成的骨缺损修复，均有良好的应用前景。

但要真正投入临床应用，目前仍有许多未解之难题[44-45]。壳聚糖由甲壳素乙酰化形成，不同的脱乙酰度将导致其所形成的糖基、分子量和生物活性均不同，因此对于构建骨修复材料的壳聚糖来说，如何找到最适合的脱乙酰度，亟待解决；壳聚糖和其他材料的配比将影响复合材料的性能和骨修复能力，其最佳配比仍需进一步研究；壳聚糖降解产物对机体的影响也有待深入考查；骨修复过程中壳聚糖促进成骨细胞增殖和成骨分化的机制亦尚需明确；随着3D打印等数字技术在骨科材料制备中的应用[46-47]，更多个性化壳聚糖复合骨修复材料亦有待研发，以满足有效修复复杂骨缺损的需求。总之，壳聚糖是一种极具潜力的骨修复材料，相信在不久的将来，壳聚糖复合材料可实现真正的临床应用，为骨缺损修复治疗开辟新的途径。

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