侵袭性肺曲霉病实验室检测方法的研究进展

宋一祎，李华茵

复旦大学附属中山医院呼吸内科，上海 200032

侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)是由曲霉菌侵入肺组织所引起的深部真菌感染性疾病，以发展成坏死性、出血性肺炎，形成多发性脓肿或肉芽肿，病灶边缘有小动脉栓塞为特征。致病菌主要有烟曲菌、黄曲菌、黑曲菌、土曲菌及构巢曲菌，其中以烟曲菌最为常见。IPA主要发生于免疫抑制人群，常见的宿主有：>10 d的中性粒细胞缺乏患者(中性粒细胞计数小于0.5×109/L)；接受同种异体造血干细胞移植或实体器官移植患者；长期应用糖皮质激素患者(平均应用最小剂量相比泼尼松为0.3 mg/kg/d，持续3周以上)；细胞免疫抑制疗法患者，如应用环孢素、肿瘤坏死因子α(TNF-α)阻滞剂、特异性单克隆抗体以及核苷类似物；遗传的免疫缺陷状态(慢性肉芽肿性疾病和严重的联合免疫缺陷病)或获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者[1]。这类患者占侵袭性肺曲霉病的80%以上。

近年来，IPA的发病率大大增加。有研究[2]显示，1978至1992年，在院内经尸检证实的IPA患者比例从9%升高至32%；同时IPA死亡率也迅速上升，病死率达80%，在器官移植患者中达95%。该研究表明，早期诊断并及时开展抗真菌治疗可使侵袭性真菌病的生存率提高80%以上，亟待解决的问题是找到一种能早期诊断且灵敏度高、特异度高的诊断方法。目前临床上主要采用欧洲癌症研究治疗组织及真菌研究组(EORTC/MSG)推荐的侵袭性真菌病的分级诊断标准[3]：确诊IPA有赖于组织病理学依据或正常无菌部位标本曲霉菌培养阳性或直接镜检阳性。临床诊断病例需要有宿主因素、临床依据和微生物学证据，其中根据是否有微生物学证据划分为probable(很可能)IPA和possibie(可能)IPA。微生物学证据在IPA的诊断中至关重要，主要通过实验室检测获得，目前侵袭性肺曲霉病的实验室检测方法主要有半乳甘露聚糖(galactomannan, GM)试验、(1,3)-β-D葡聚糖(BDG)试验(G试验)、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术、免疫层析侧流装置(lateral-flow device,LFD)技术及一些新兴的实验室检测方法[4-5]。本文就此类检测方法诊断IPA作一综述。

1 GM抗原检测

GM是曲霉菌细胞壁特异的组成部分，在曲霉菌侵犯组织早期可释放人血，并且这种抗原血症可持续1～8周。因此，GM在血清中出现较早且存在时间较长，特异度和灵敏度相对较高，对IPA的早期诊断及治疗监测更有价值。GM试验在粒细胞缺乏患者中的诊断价值被多项研究证实，文献[6-7]报道其诊断的灵敏度和特异度分别为61%～89%和84%～95%。而最近一项在非粒细胞缺乏患者中开展的研究[8]表明，血清GM试验诊断的灵敏度和特异度分别为37.84%和87.14%，支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage, BAL)液GM试验的灵敏度和特异度分别为75.68%和80.72%(当ODI值>0.5为阳性临界值时)。但GM试验目前存在的缺点在于：(1)GM检测有假阳性干扰，如使用哌拉西林三唑巴坦后血清GM会出现阳性，可能与某些交叉反应有关。(2)其特异度和灵敏度波动范围大，并极大地依赖于测试的人群、检测标本的种类以及抗真菌药的使用，如血液恶性肿瘤患者或接受过造血干细胞移植的患者GM试验的灵敏度高于免疫功能正常的患者(可能与免疫正常宿主对侵入血管的曲霉菌清除有关)；使用经验性或预防性抗真菌药物治疗后GM试验的灵敏度降低；BAL液与血清相比，GM试验灵敏度更高。(3)尽管GM试验已经应用了很长时间，但其阳性结果的最佳临界值仍尚未确定，因此为临床应用带来了些许不足。目前较多研究[9-10]采用血清GM试验ODI值>0.5、BAL液GM试验ODI值>1.0作为阳性临界值，但也有少数研究[11]表明当BAL液GM试验ODI临界值为0.8时，具有最大的ROC曲线下面积(AUC)。

2 BDG检测

BDG是大部分真菌细胞壁的共同成分(接合菌、隐球菌除外)，检测血循环或BAL液中的BDG可对系统性真菌感染进行筛查，此法灵敏度可达1 ng/L，特异度高，有着极佳阴性预测值。近期的一项Meta分析[12]显示，G试验在诊断真菌感染中的灵敏度和特异度分别为77%和85%。而G试验缺点在于：(1)无法区分真菌种类。(2)早期诊断意义不大，对抗真菌治疗患者进行连续监测，发现BDG在治疗中期才高浓度出现在血液中，所以BDG虽然可以监测病情变化和抗真菌治疗效果，但血液峰浓度出现较迟。(3)检测结果容易受多种因素影响，常见的干扰因素有应用纤维素膜进行的腹膜透析治疗，应用静脉制剂(白蛋白、免疫球蛋白等)、纱布或其他医疗物品(外科手术)及某些细菌败血症等。(4)某些曲霉菌种，如毛曲霉菌的细胞壁不含有BDG，限制了G试验对该种曲霉的检测。

3 PCR技术

PCR是在体外模拟体内核酸复制从而获得大量目的基因的技术，于20世纪90年代开始应用于曲霉菌DNA检测，检测靶点主要包括曲霉核糖体DNA(ribosomal DNA, rDNA)以及线粒体DNA[13]。由于PCR反应具有灵敏度高，反应周期较传统培养、GM试验短的特点，被认为是一种极有前景的诊断方法。然而，PCR技术检测曲霉菌存在方法学标准化困难，对实验场地的配置、实验操作规范性、操作人员的要求较高，以及传统PCR、巢式PCR技术存在容易污染样本，假阳性率高，不能量化等缺点，未能大规模应用。

实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)的出现弥补了这一不足：RT-qPCR是在传统PCR基础上加入信号系统达到实时监测PCR扩增的目的，继承了传统PCR高灵敏度和操作简便的特点，同时实现了对样本的定量检测。根据信号基团的不同，RT-qPCR可以分为染料法和探针法[14]。非特异的染料法成本较低，但面临着类似于普通PCR非特异性扩增产物干扰的假阳性问题；探针法中使用的探针多是 TaqMan探针，与染料法相比，假阳性出现概率更低[15]。此外，欧洲曲霉PCR行动委员会(European aspergillus PCR initiative, EAPCRI)关于曲霉DNA提取方式、PCR扩增方案、样本种类及数量、反应条件和体系等的标准化操作建议不断被完善[16-17]，例如推荐当使用全血标本时应使用≥3 mL全血，需先裂解红细胞和白细胞；提取DNA所用的洗脱液应小于100 μL，并设置阳性对照和阴性对照等。

2014年，Arvanitis等[18]发表了一项包含25项研究、2 595个病例的meta分析，旨在评价PCR技术在高危血液系统疾病患者血液样本(包括全血和血浆)中的诊断价值，结果显示：PCR诊断试验在血液样本中的灵敏度和特异度分别为84%和76%；当同一患者至少2个样本PCR试验阳性时，阳性似然比为12.8。2016年，Imbert等[19]研究证实了这一结论，该研究纳入了来自941例患者(其中51例患者被诊断为确诊/很可能IPA)的5 146个血清样本，结果表明血清PCR阳性诊断IPA的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为66.7%、98.7%、75.6%和98.0%，与血清GM试验相比，PCR试验受粒缺和非粒缺因素影响更小，假阳性率更低。在疾病监测方面，当样本DNA载量以150拷贝/mL为临界值时，对患者90 d死亡率可能性高低具有很好的区分价值。该研究还发现，当结合GM试验和PCR试验(二者之一阳性即为阳性标准)时，诊断IPA的灵敏度可高达88.2%。

PCR试验在BAL液中的灵敏度被认为比血液标本中更高，与之相关的机制可能是：(1)BAL液标本是从病灶邻近处获取，因此曲霉菌载量更高。(2)从曲霉初始感染至入侵肺泡毛细血管壁往往需要24 h左右，因此BAL液检测相比于血液学检测更有利于早期诊断[20]。在一项包含了116例患者的多中心的回顾性临床研究[21]中，发现PCR诊断试验在BAL液中的灵敏度和特异度分别为78%和79%，其灵敏度结果与2007年的一项关于PCR在BALF中诊断价值的meta分析[22]结果相近(灵敏度79%，特异度94%)，然而特异度却有所下降，可能与使用巢式PCR法、样本被污染、无法区分是定植或感染有关。而2016年的一项采用RT-qPCR法检测BAL液中曲霉菌的研究[23]表明，在BAL液样本中，qPCR和GM试验都具有良好的灵敏度(90%vs90 %)；但是qPCR的特异性明显高于GM试验(92.5%vs68.8%，P<0.001)。分析这一结果与前者不同的原因在于，由于实现了实时荧光定量，原始样本的DNA拷贝浓度与最后的荧光循环阈值(ct)值相关，从而可以更好地区分定植与感染。由此可见，当使用设计良好、试验过程精确定量的qPCR方法来检测曲霉DNA时，无论其灵敏度和特异性均优于GM试验。

此外，PCR技术目前也可用于活检组织的曲霉DNA检测，是对传统组织培养及镜检的一种补充性诊断方法，并且有助于真菌种属的鉴别[24-25]。关于PCR技术在胸腔积液、痰液等体液标本中的诊断价值相关文献报道甚少，有待进一步研究。

4 LFD技术

2008年，Thornton[26]利用烟曲霉的冻干菌丝免疫小鼠，制备了一株单克隆抗体MAb JF5，其针对的抗原是一种糖蛋白，该体外研究表明，该糖蛋白在曲霉快速活跃生长期连续分泌，其主要分布在菌丝细胞壁、胞间隔和围绕细胞的荚膜层中。LFD是利用该抗体研发的一种快速诊断IPA的免疫层析侧流装置，为胶体金颗粒标记的MAb JF5作为检测试剂加载到胶体金结合垫上，同时未标记的MAb JF5被固定在硝酸纤维膜的捕获区。血清或BAL液中的抗原加入样品垫后，由于虹吸作用向前移动，首先与金标抗体结合，胶体金-抗体-抗原复合物移动到捕获区，再与固定的MAb JF5结合，形成一条肉眼可见的红线，显色强度与抗原浓度成正比，检测结果被判为阴性、弱阳性、中等阳性或强阳性。测试结果在加样后10～15 min后即可观测。

2012年12月至2013年5月，Hoenigl等[27]收集了来自澳大利亚和德国两所教学医院的78个病例(具有IPA的危险因素)，采集了78份BAL液样本，结果显示LFD试验诊断的灵敏度和特异度分别为80%和95%，阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)也分别为80%和95%，诊断优势比为78。然而在随后开展的一项自2013年5月至2014年12月的研究[28]中，对来自72例患有血液系统肿瘤患者的95份BAL液样本进行了分析，发现LFD的灵敏度、特异度、PPV和NPV分别为71%、76%、35%和94%。分析LFD试验的灵敏度有所下降可能与纳入人群的特点有关(前者在收集BAL液的同时较少受抗真菌治疗的影响)。此外，类似于PCR试验，当结合BAL液的GM试验和LFD试验作为联合诊断措施时，IPA的灵敏度可达94%，特异度可达93%，诊断优势比可达219[29-30]。由此看来，LFD试验具有简便、快速的特点，且诊断价值较好，尤其具有良好的阴性预测价值。

关于LFD的IPA诊断价值还存在许多亟待解决的问题。首先，LFD是定性试验，阳性结果判读完全依赖操作人员的主观评估，可能会造成结果的偏差；其次，目前关于LFD的研究检测样本仅限于血液和BAL液，没有对尿液等其他体液进行检测，而且上述实验还未经大量临床样本验证；最后，关于LFD试验的商业化检测目前还存在困难。因此，LFD在临床上应用的推广还需进一步的探讨。

5 其他诊断方法

5.1 醋酸镰孢氨酸C(triacetylfusarinine C, TAFC) TAFC是烟曲霉菌在感染宿主后转运铁过程中产生的一种分泌型的小分子螯合剂。在一项包含44个BAL液样本的研究[31]中，TAFC检测的灵敏度、特异度、PPV、NPV分别为40%、79%、50%和72%。但当结合TAFC和GM试验结果时，其诊断IPA的灵敏度可达87%。但由于TAFC在其他一些真菌(镰孢菌的成熟期)也可检测到，因而不具有曲霉特异性。此外，关于这种新型标志物最佳临界值以及在其他体液标本中的表现等需要后续更多的研究来证实。

5.2 二甲硫基胶霉素(bis-methylthio gliotoxin, bmGT) 胶霉毒素作为烟曲霉产生的真菌毒素之一，对哺乳动物细胞具有免疫抑制及促凋亡作用。其通过抑制NAPDH氧化酶活性进而抑制粒细胞抗微生物作用。在侵袭性曲霉病动物模型和临床确诊患者血清中均可检测到胶霉毒素，预示其可作为曲霉病诊断指标。而bmGT是胶霉素甲基化产生的一种更为稳定的代谢产物。Vidal-García等[32]做了一项来自90例高危患者的357个血清样本检测，发现血清bmGT的灵敏度、特异度、PPV、NPV分别为61.5%、93.0%、25.0%和98.5%，与GM试验相结合时，PPV和NPV分别可达100%和97.5%。是一种颇有前景的血清标志物，但仍需大量研究证实。

5.3 电子鼻(eNose) eNose是动物嗅觉系统研究成果、传感器技术与电子学和计算机技术结合的产物，主要由具有部分选择性的传感器阵列和模式识别系统组成，是一种通过传感器的部分专一性和系统的模式识别功能，来检测简单或复杂气味的电子仪器。其广泛用于生物的鉴别、药物的分类与判别。临床上，eNose可通过分析呼出气中包含的各种挥发性有机化合物的不同从而鉴别不同的肺部疾病，数分钟内即可得出结果。Heer等[33]开展的一项单中心、前瞻性研究中，包含了46例受试者，结果显示，交叉验证后的eNose诊断的灵敏度和特异度分别为100%和83.3%。AUC为0.93。该研究存在的问题是，样本量太小，需要进一步加大样本量来验证这一结论；其次，eNose得到的信息代表所测样品中全部挥发物的总体分布，而不是常规仪器的分析测得的某种或某几种具体组成的含量，无法区分是曲霉感染后产生的哪一种或哪几种气体导致了气体指纹的不同；另外，电子鼻价格昂贵，从“台式”到“手持式”价格也从一万美元至十多万美元不等。

5.4 呼出气冷凝液(exhaled breath condensate, EBC)试验 EBC试验实际上也是检测EBC中的GM含量，相较于检测BAL液的GM试验而言，创伤更小。但是其检测效果还不能确定。最近由Bhimji等[34]开展的一项在肺移植者中进行的前瞻性研究表明，相对于健康人，患者EBC中的GM含量更高(P<0.0001)。然而，检测EBC中的GM未能得出一个有效的界定值(AUC只有0.46)。并且该研究还发现，EBC中GM试验和同时采集的BAL液中GM试验的结果并无相关性。

5.5 质谱分析法 真菌在感染宿主细胞的过程中会产生一系列真菌毒素，其中最具有杀伤力的是一种被称为真菌铁载体的蛋白。基质辅助-激光解吸电离质谱分析法可以检测血液、尿液以及肺组织中此种蛋白的含量，检测极限可达到0.28～0.36 ng/mL，特别是在组织标本中检测这种由真菌代谢产生的物质，可减少由直接镜检得出的假阳性结果。这种检测方法具有很好的应用前景，但目前缺少在人群研究中的证实。

6 小 结

IPA的早期诊断仍然是临床上的一个难题。传统的真菌培养及显微镜检查方法是确诊曲霉菌感染的金标准，但由于其阳性率低，培养周期长已经不适合临床工作；而GM试验已得到广泛应用，且被EORTC/MSG纳入微生物学证据之一，肯定了其诊断IPA的价值，但存在易受患者疾病状态影响、抗真菌疗法干扰及某些药物影响的不足。此外，qPCR及LFD同样具有不低于GM试验的诊断价值，且操作更简便，诊断时间更短，有利于指导及监测抗真菌治疗，但由于存在标准化操作流程尚未统一、最佳临界值无法确定及商业化试剂的缺乏等缺点，限制了在临床上的应用。一些新兴诊断方法为IPA的诊断提供了思路，但仍需要更多相关研究证实。结合多种试验可以显著提高IPA的诊断效率，这一结论已经在多项研究中得到证实，为后续的研究及临床应用提供了方向。