TLRs通过STAT3促进乳腺癌细胞PD-L1表达的实验研究

白云龙，王建杰*

（佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007）

免疫系统对肿瘤细胞具有监视和杀伤作用，而肿瘤则可通过多种免疫逃逸机制抵抗或逃避免疫系统对肿瘤细胞的杀伤和清除，三阴性乳腺癌和孕激素/雌激素受体阳性乳腺癌是否通过调控程序性死亡受体1配体（PD-L1）介导肿瘤细胞免疫逃避不清楚[1-2]，本研究将通过探索TLRs信号通路对乳腺癌细胞株PD-L1表达的调控机制，研究PD-L1和TLRs的调控关系，提高乳腺癌治愈率提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

乳腺癌细胞株MCF-7与MDA-MB-231细胞株购自诺辰生物公司；胎牛血清购自澳大利亚clark公司；L15和RPMI-1640培养基购自gibco公司；TAK-242 TLR4抑制剂购自APEXBIO公司；LPS、TLR4样受体激活剂购自碧云天公司；抗PD-L1，STAT3兔源多克隆抗体购自成都正能生物技术公司；抗PD-L1鼠源单克隆抗体购自sigama公司；STAT3 siRNA干扰质粒由上海吉凯基因公司合成。

1.2 Western Blotting

细胞长满培养瓶壁，预冷PBS冲洗，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解，离心，取上清，加入buffer，电泳；半干式转膜，脱脂乳封闭，孵育过夜，二抗孵育，上机检测。

1.3 细胞转染

将两株细胞分别接种于六孔板中，分为无任何处理组、STAT3过表达组、siRNA-STAT3组、无义siRNA组、空载体质粒组，脂质体3000转染，48小时后制作检测样品，上机检测。

1.4 统计学处理

Western blotting均重复三次，随后的各组实验结果取平均值，计算各组数据的标准差、标准误。计量资料两组比较用配对样本t检验、两样本t检验和多样本的LSD-t检验，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结 果

2.1 TLRs促进乳腺癌细胞PD-L1表达

MDA-MB-231细胞PD-L1的表达量高于MCF-71.9倍（P＜0.01），用LPS激活TLRs时，MCF-7细胞膜上PDL1表达量上调1.5倍（P＜0.01），MDA-MB-231细胞膜上PD-L1表达量上调2.4倍（P＜0.01）；用TAK-242抑制TLRs时，MCF-7细胞膜上PD-L1表达水平则下调1.7倍（P＜0.05），MDA-MB-231细胞无显著变化。

2.2 STAT3是TLRs的下游转录因子

MDA-MB-231中STAT3的表达量高于MCF-72.2倍（P＜0.01）；用LPS处理MCF-7细胞中STAT3表达水平3.1倍（P＜0.001），提高MDA-MB-231细胞中STAT3表达水平1.9倍（P＜0.01）；而TAK-242处理则下调了MCF-7细胞中STAT3表达水平1.6倍（P＜0.01），MDA-MB-231细胞变化不显著。

2.3 TLRs通过STAT3信号通路促进乳腺癌细胞PD-L1表达

在MCF-7和MDA-MB-231细胞中采用STAT3 siRNA敲减STAT3表达及用STAT3质粒升高STAT3表达；结果发现敲减STAT3可减少MCF-7细胞STAT3表达4.4倍（P＜0.01），STAT3质粒升高则1.9倍（P＜0.05）；敲减STAT3减少MDAMB-231细胞STAT3表达2.8倍（P＜0.001），敲减STAT3可分别减少MCF-7和MDA-MB-231细胞膜上PD-L1表达水平2.2倍和4.2倍（P＜0.001）；反之高表达STAT3则分别提高5.2倍和3.8倍（P＜0.001）。

3 讨 论

免疫系统对肿瘤细胞具有监视和杀伤作用，而肿瘤则可通过多种免疫逃逸机制抵抗或逃避免疫系统对肿瘤细胞的杀伤和清除[3-4]。从本实验结果来看，用LPS刺激后PDL1的表达均上调，PD-L1的表达增加与降低是随着STAT3的表达变化而变化的，证实STAT3是PD-L1的转录因子；TLRs信号通路可以通过STAT3上调PD-L1的表达来介导肿瘤免疫逃逸，本研究结果证明三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的PD-L1蛋白的表达量要高于孕激素/雌激素受体阳性乳腺癌细胞株MCF-7细胞株，证明PD-L1与TLRs信号通路的密切关系。本研究首次在乳腺癌中发现了TLRs通过STAT3信号通路对PD-L1的表达调控作用，为联合干预TLRS和PDL1抑制肿瘤免疫逃避，提高乳腺癌治疗效果提供了科学依据。