加味独活寄生合剂促进膝骨关节炎软骨修复疗效及作用机制研究

张永辉++欧梁++邝高艳++卢敏

摘要：目的 探討加味独活寄生合剂促进膝骨关节炎（KOA）软骨细胞增殖的临床疗效及其作用机制。方法 采用随机数字表法将60例患者随机分为治疗组和对照组各30例。治疗组予加味独活寄生合剂，每次62.5 mL，每日2次，口服；硫酸氨基葡萄糖胶囊，每次1粒，每日3次，口服。对照组予双醋瑞因胶囊，每次1粒，每日2次，口服；硫酸氨基葡萄糖胶囊，用法用量同治疗组。嘱患者行股四头肌舒缩功能锻炼，注意保暖。连续治疗6周。观察2组治疗前后视觉模拟评分法（VAS）评分、西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数（WOMAC），检测患膝关节液白细胞介素-1（IL-1）、一氧化氮（NO）、Wnt5a、β-连环蛋白（β-catenin）、Sox9、胶原蛋白Ⅱ（CollagenⅡ）含量，监测不良反应。结果 与本组治疗前比较，2组治疗后IL-1、NO、Wnt5a、β-catenin含量明显降低（P<0.05），Sox9、CollagenⅡ含量明显升高（P<0.05），VAS评分、WOMAC明显降低（P<0.05），以上指标2组治疗后比较差异无统计学意义（P>0.05）。2组均未见明显不良反应。结论 加味独活寄生合剂可降低关节液中炎症因子水平，抑制Wnt信号通路，通过调节通路中Sox9、CollagenⅡ表达促进KOA软骨细胞的增殖分化，有效缓解疼痛并改善关节功能。

关键词：加味独活寄生合剂；膝骨关节炎；软骨修复

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.007

中图分类号：R274.94 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）01-0028-05

Clinic Efficacy and Action Mechanism of Promoting Repairment of Knee Osteoarthritiss Cartilage Corpuscle via Modified Duhuo Jisheng Mixture

ZHANG Yong-hui1， OU Liang1， KUANG Gao-yan1， LU Min2

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China；

2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China

Abstract： Objective To discuss the clinic efficacy and its mechanism of action in promoting the cell proliferation of knee osteoarthritiss cartilage corpuscle via modified Duhuo Jisheng Mixture. Methods Totally 60 cases were divided into treatment group and control group by random number table method， with 30 cases in each group. Treatment group was given modified Duhuo Jisheng Mixture， 62.5 mL each time， twice a day， orally， and sulfoglycan sulfate capsules， 1 capsule a day， three times a day， orally； while control group was given diacerein capsules， 1 pill a day， twice a day， orally， and sulfoglycan sulfate capsules， the same as treatment group. Patients were required to do quadriceps muscle systolic and functional exercise， and keep warm. The treatment lasted for 6 weeks. VAS score and WOMAC of the two group were observed before and after treatment. IL-1， NO， Wnt5a， β-catenin， Sox9， Collagen Ⅱ in knee joint fluid were detected. Adverse reactions were monitored. Results Compared with pre-treatment， the contents of IL-1， NO， Wnt5a and β-catenin in two groups were reduces （P<0.05）； while the contents of Sox9 and Collagen Ⅱ were raised （P<0.05）. The VAS scores and WOMAC were reduced in two groups after treatment （P<0.05）. There was no statistical significance between the two group in the above indexes （P>0.05）. There were no obvious adverse reactions in both groups. Conclusion Modified Duhuo Jisheng Mixture can reduceendprint

基金项目：国家自然科学基金（81574004）；湖南省中医药管理局课题（201408）

通讯作者：卢敏，E-mail：lumin6563@163.com

inflammatory factors of the joint fluid and inhibit the Wnt signal pathway through regulating the expression of Sox9 and Collagen Ⅱ in the pathway， which can promote the cell proliferation of knee osteoarthritis's cartilage corpuscle and benefit the repairment of cartilage corpuscle in order to relieve pains and improve functions of knee joint.

Keywords： modified Duhuo Jisheng Mixture； knee osteoarthritis； repairment of cartilage corpuscle

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是中老年常见疾患，随着病情逐渐加重，严重影响患者的生活质量。近年来，中医药治疗KOA取得了良好疗效[1-3]，但发病机制尚不明确，缺乏特异性疗法。目前基础研究主要针对中医药对KOA中软骨的细胞因子某一基因层面的干预作用，多局限于补肾活血类或补肾类药物对KOA的干预作用，尚未系统阐明补肾活血、祛痹止痛中药治疗KOA的作用靶点基因和调控通路。本研究采用自拟加味独活寄生合剂，治疗肝肾亏虚、风寒湿痹型KOA，观察其疗效及对关节液内Wnt信号通路相关蛋白含量的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年10月-2017年3月湖南中医药大学第一附属医院骨伤科门诊患者60例，采用随机数字表法分为治疗组和对照组各30例。治疗组男性8例，女性22例，平均年龄（59.2±3.5）岁，平均病程（3.6±1.8）年；对照组男性11例，女性19例；平均年龄（58.1±3.4）岁，平均病程（3.7±1.6）年。本研究无脱落、退出病例。2组患者年龄、性别、病程、视觉模拟评分法（VAS）评分及西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数（WOMAC）比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会审查批准。

1.2 西医诊断标准

参照《骨关节炎诊治指南（2007年版）》[4]制定诊断标准。①近1个月内反复膝关节疼痛；②X线片示关节间隙变窄，软骨下骨硬化和/或囊变，关节缘骨赘形成；③关节液透明、黏性，检查示白细胞<2000个/mL；④年龄≥40岁；⑤晨僵时间≤30 min；⑥活动时感觉有骨摩擦音。具备上述①②或①③⑤⑥或①④⑤⑥即可明确诊断。

X线分级采用骨关节炎Kellgren-Lawrance分级标准[5]。0级：正常；Ⅰ级：轻微骨赘；Ⅱ级：明显骨赘，关节间隙可疑变窄；Ⅲ级：关节间隙中度变窄，软骨下骨硬化；Ⅳ级：大量骨赘，关节间隙明显变窄，严重软骨下骨硬化及明顯畸形。

1.3 中医辨证标准

参照《中医病证诊断疗效标准》[6]风寒湿痹、肝肾亏虚证进行辨证。主症：关节酸痛或部分肌肉酸重麻木，迁延日久可致肢体拘急，甚则关节肿大。次症及舌脉：肢体关节走窜疼痛，痛无定处，有时兼有寒热，舌苔黄腻、脉浮；遍身或局部关节疼痛，痛有定处，得热稍缓，遇冷则剧，苔白，脉弦紧；关节酸痛、肌肤麻木、痛有定处，阴雨风冷可使其发作，苔白腻，脉濡缓。脉沉细或沉弱无力。具备主症，参照次症及舌脉即可辨证。

1.4 纳入标准

①性别不限，年龄50～65岁；②符合上述西医诊断标准及中医辨证标准者；③X线分级为0～Ⅱ级者；④无严重心、肺及肝、肾功能障碍者；⑤近2个月内未服用相关药物或采用相应治疗方案者；⑥患者自愿参加本研究并签署知情同意书，依从性良好者。

1.5 排除标准

①对本研究药物过敏者；②X线分级为Ⅲ、Ⅳ级者；③慢性结肠炎、腹泻、服用改善肠道转运和/或肠道内容物性质的药物、服用含有氢氧化铝和/或氢氧化镁的药物者；④创伤性膝关节炎者；⑤有严重的心、肺及肝、肾功能障碍者；⑥近期拟怀孕、妊娠期及哺乳期患者。

1.6 治疗方法

治疗组予加味独活寄生合剂。药物组成：独活6 g，桑寄生18 g，制天南星6 g，黄芩6 g，木瓜12 g，威灵仙12 g，杜仲12 g，牛膝6 g，细辛3 g，秦艽6 g，茯苓12 g，肉桂3 g，防风6 g，川芎6 g，党参12 g，甘草3 g，当归12 g，白芍10 g，熟地黄15 g。湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，批号201601。每次62.5 mL，每日2次，口服；硫酸氨基葡萄糖胶囊（浙江海正药业股份有限公司，批号7108197，0.314 g/粒），每次1粒，每日3次，口服。

对照组予双醋瑞因胶囊（TRB Pharma S.A.，昆明积大制药股份有限公司，批号69577，50 mg/粒），每次1粒，每日2次，口服；硫酸氨基葡萄糖胶囊，用法用量同上。

嘱患者行股四头肌舒缩功能锻炼，注意保暖，勿进行加重膝关节负重的活动。均连续治疗6周。

1.7 观察指标

1.7.1 视觉模拟评分法评分

于治疗前后对2组患者行VAS评分[7]。在设定好的评分表上划一条10 cm的线，横线的一端为0，表示无痛，另一端为10，表示剧痛，患者根据疼痛感觉进行评分。endprint

1.7.2 西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数

参考文献[8]于治疗前后评价WOMAC，包括疼痛、僵硬和关节功能3个部分，共24个项目（包括疼痛5个、僵硬2个、关节功能17个）。WOMAC越高，表示关节炎越严重。<80分为轻度，80～120分为中度，>120分为重度。

1.7.3 患膝关节液相关指标

2组于治疗前后行关节腔穿刺抽取关节液。患者仰卧位，膝下垫枕，取髌骨外上方入路，定位准确后碘伏消毒，抽取关节液1 mL，置于无菌管。ELISA检测IL-1、NO、Wnt5a、β-catenin、Sox9、CollagenⅡ含量，严格按照试剂盒（DG biotech公司，批号分别为E-EL-H0149c、A013-2、E-EL-H1038c、E-EL-H0666c、E-EL-H1349c、E-EL-H0787c）说明进行操作。

1.7.4 不良反应

观察2组治疗期间有无腹泻、腹胀等不良反应并记录。

1.8 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以

—x±s表示，组间比较采用t检验及非参数检验；计数资料组间比较采用卡方检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 视觉模拟评分法评分及西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数比较

与本组治疗前比较，2组治疗后VAS评分、WOMAC均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；2组治疗后VAS评分、WOMAC比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 2组患膝关节液白细胞介素-1、一氧化氮含量比较

与本组治疗前比较，2组患膝关节液IL-1、NO含量明显降低（P<0.05），2组治疗后比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 2组患膝关节液Wnt5a、β-连环蛋白、Sox9、胶原蛋白Ⅱ含量比较

与本组治疗前比较，2组治疗后患膝关节液Wnt5a、β-catenin含量明显降低（P<0.05）；2组治疗后比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。与本组治疗前比较，2组治疗后Sox9、CollagenⅡ含量明显升高（P<0.05）；2组治疗后比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

2.4 不良反应

对照组轻度腹泻2例；治疗组轻度腹胀、消化不良1例。2组均无明显不良反应。

3 讨论

KOA属于中医“痹证”范畴，称之为“膝痹”。《素问·痹论篇》认为“风寒湿三气杂至，合而为痹”，“骨痹不已，复感于邪，内舍于肾”。《张氏医通》认为：“膝者筋之府，膝痛无不因肝肾亏虚者，虚则风寒湿气袭之。”中医对该病的病机认识以肾虚邪实为主，治以补虚泻实。

本研究选用独活寄生汤加黄芩、木瓜、威灵仙、制南星，制成加味独活寄生合剂。本方重用善治久痹伏风的独活，加大桑寄生、杜仲、牛膝用量以补益肝肾；木瓜、威灵仙祛风散寒除湿，二药配伍刚柔相济，入腑通络，善治湿邪久病入络、病变位置较深者；制南星善入经络，辛温散寒燥湿止痛，黄芩取反佐之意，苦寒清热，制约全方温燥之性。诸药合用，共奏补益肝肾、祛风除湿、散寒止痛之功。

IL-1、NO是关节液中炎症因子，二者可引起关节液和滑膜的免疫炎症反应，NO是促细胞凋亡的重要因子，IL-1β可依赖内源性NO诱导细胞凋亡，进一步促进关节软骨的凋亡破坏，在KOA发病中具有重要作用。药理研究表明，黄芪苷能够明显降低血清中IL-1含量，木瓜三萜可抑制RAW264.7细胞分泌IL-1等促炎因子而发挥抗炎作用，威灵仙水提取液可降低兔KOA局部IL-1β、TNF-α，大劑量制天南星可降低兔KOA关节液中IL-1含量，减轻滑膜炎症[9-12]。邝高艳等[13]认为，加味独活寄生合剂可减少关节液中IL-1、IL-6、TNF-α及NO含量，抑制炎症反应，改善临床症状，这可能是加味独活寄生合剂治疗KOA的作用机制。

双醋瑞因胶囊是目前临床治疗KOA的阳性药物，研究表明，应用4～6周即能对膝关节的疼痛和临床功能的改善取得良好效果，可降低IL-1含量，同时诱导关节软骨的增殖分化。本研究表明，2组患者IL-1、NO及VAS评分、WOMAC在治疗后均明显降低，表明加味独活寄生合剂可降低患膝关节液中炎症因子含量，对KOA有良好的疗效。2组比较差异无统计学意义，也在一定程度上表明加味独活寄生合剂与双醋瑞因胶囊疗效相当。

KOA主要是由于关节软骨退变磨损产生炎症介质刺激所致，是力学和生物学因素共同作用的结果。KOA的严重程度与软骨细胞凋亡密切相关。现代研究表明，Wnt信号通路在骨骼发育、软骨及骨生物学中起着关键作用，通过Wnt信号通路调节能够促进软骨细胞的增殖、分化，从而改善KOA的临床症状。彭旭等[14]研究表明，Wnt3a/β-catenin信号阻断后，CollagenⅡ、aggrecan、Sox9表达明显恢复，细胞增殖能力和向软骨诱导分化的能力有所恢复。Gurusinghe S等[15]提取8～12个月健康雄性犬的软骨细胞进行随机对照研究发现，Sox9组能恢复软骨细胞表型的扩张，此外，软骨细胞经Sox9和CollagenⅡ作用后，其特异性表达明显增强。卓群豪等[16]研究也表明，Sox9转染小鼠骨髓间充质干细胞对小鼠膝关节炎病变软骨修复有促进作用。以上研究表明，Wnt信号通路在调节软骨细胞增殖方面具有一定作用，而Sox9和CollagenⅡ在软骨细胞的增殖分化中具有重要作用。

近年来，中医药在治疗KOA方面取得了较好的疗效，但其是否通过Wnt信号通路调节尚不明确。2组在评价临床效果的同时，重点检测了Wnt信号通路相关调节蛋白，尤其是Sox9基因蛋白和CollagenⅡ，以观察加味独活寄生合剂是否能够通过调节该信号通路来促进软骨细胞增殖修复。Wnt信号通路中Wnt5a、β-catenin蛋白较治疗前明显降低，Sox9和CollagenⅡ较治疗前明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。这说明应用加味独活寄生合剂后Wnt信号通路被抑制，尤其是其关键蛋白β-catenin含量降低。有研究指出，β?catenin能与Sox9的C端转录激活域结合，从而抑制Sox9启动目的基因的转录[17]，而β-catenin含量降低，相应能够促使Sox9蛋白分泌增多，利于CollagenⅡ蛋白产生，诱导软骨细胞的增殖和向软骨组织分化，从而修复KOA磨损的软骨组织。endprint

总之，本研究中加味独活寄生合剂能降低关节液中的炎症因子含量，且通过调节Wnt信号通路促进KOA软骨细胞增殖，起到保护关节软骨的作用。但本研究样本量较小，观察时间有限，仍有待进一步深入研究。

参考文献：

[1] 时晶，简文佳，魏明清，等.王永炎活血、化瘀、通络三步法[J].中医杂志，2014，55（23）：1993-1995.

[2] 唐萌芽，翁祝承，邵利芳.中药治疗膝骨关节炎临床疗效和安全性的系统评价[J].中医正骨，2014，26（1）：43-48.

[3] 谭开云，卢敏.加味独活寄生合剂治疗风寒湿痹、肝肾亏虚型膝骨关节炎临床疗效观察[J].中华中医药学刊，2016，34（2）：425-427.

[4] 中华医学会骨科学分会.骨关节炎诊治指南（2007年版）[J].中华骨科杂志，2007，27（10）：793-796.

[5] KELLGREN J H， LAWRENCE J S. Radiological assessment of osteo- arthrosis[J]. Ann Rheum Dis，1957，16（4）：494-502.

[6] 国家中医药管理局.中医病证诊断疗效标准[M].南京：南京大学出版社，1994：30.

[7] SVENSSON I， SJ?STR?M B， HALJAM?E H. Assessment of pain experiences after elective surgery[J]. J Pain Symptom Manage， 2000，20（3）：193-201.

[8] BELLAMY N， BUCHANAN W W， GOLDSMITH C H， et al. Validation study of WOMAC：a health status instrument for measuring clinically important patient relevant outcomes to antirheumatic drug therapy in patients with osteoarthritis of the hip or knee[J]. J Rheumatol，1988，15（12）：1833-1840.

[9] 高金灵，李振英，刘玮，等.黄芩苷对佐剂性关节炎血清中IL-1、IL-17、TGF-β表达的影响[J].黑龙江医药科学，2016，39（2）：63-64.

[10] 石孟琼，覃慧林，张永峰，等.木瓜三萜对脂多糖诱导下RAW264.7细胞炎症模型细胞因子的影响[J].中药药理与临床，2016，32（3）：76-80.

[11] 周效思，周凯，封芬，等.威灵仙对兔膝骨关节炎IL-1β、TNF-α、PGE2的影响[J].时珍国医国药，2011，22（5）：1143-1144.

[12] 刘艳平，李晓成，李引刚.制天南星对兔膝骨关节炎关节液IL-1和关节滑膜的影响[J].河南中医，2013，33（8）：1253-1255.

[13] 邝高艳，严可，柴爽，等，加味独活寄生合剂治疗膝骨关节炎临床疗效及对关节液中IL-1，IL-6，TNF-α及NO的影响[J].中国实验方剂学杂志， 2017，23（1）：174-178.

[14] 彭旭，陈光兴，杨柳，等.Wnt3a/β-catenin信号通路诱导人关节软骨间充质祖细胞增殖能力和向软骨分化的能力[J].第三军医大学学报， 2013，35（6）：477-481.

[15] GURUSINGHE S， YOUNG P， MICHELSEN J， et al. Suppression of dedifferentiation and hypertrophy in canine chondrocytes through lentiviral vector expression of Sox9 and induced pluripotency stem cell factors[J]. Biotechnol Lett，2015，37（7）：1495-1504.

[16] 卓群豪，张伟娜，李舰，等.膝关节腔内注射Sox9转染骨髓间充质干细胞修复膝关节骨关节炎[J].中国组织工程研究，2017，38（5）：736-741.

[17] AKIYAMA H， LYONS J P， MORI-AKIYAMA Y， et al. Interactions between Sox9 and beta-catenin control chondrocyte differentiation[J]. Genes Dev，2004，18（9）：1072-1087.

（收稿日期：2017-05-18）

（修回日期：2017-06-05；編辑：季巍巍）endprint