离子通道病基因检测的进展及临床应用评价*

田少华 张树龙

离子通道病多数由编码心脏离子通道的基因异常所引起，如长QT综合征(LQTS)、 Brugada综合征(BrS)、儿茶酚胺敏感性室性心动过速( CPVT)、J波综合征(JWSs)等。离子通道病的基因检测在诊断、预防及治疗上扮演着重要角色，越来越受到学者的关注。随着新一代测序技术(NGS)的展开，使得基因检测变得越来越容易，越来越多的致病基因和变异被筛选出来。离子通道病基因检测的潘多拉盒子似乎要打开了，但事实真的如此吗？笔者将对离子通道病基因检测的最新进展和相关离子通道疾病基因检测的应用评论作一综述。

1 离子通道病基因检测的新进展

近些年，随着离子通道病共识的推出，离子通道病的基因检测在诊断、预防及治疗上扮演着重要角色，越来越受到学者的关注。近两年，离子通道病的基因检测又有了一些新的进展。

1.1LQTS的基因检测 根据孟德尔遗传定律，LQTS分为两种类型：多数为常染色体显性遗传的RW综合征(Romano-Wardsyndrome syndrome)，少数为常染色隐形遗传的JLN综合征(Jervell Lange-Nielsen syndrome )。以往研究认为RWS相关突变基因有13个，但Marsman等[1]通过更先进的NGS技术筛选基因组范围内的罕见致病基因，发现表达钙调蛋白的CALM1、CALM2基因变异与LQT有关，这一发现使RWS的候选基因库增加到15个。但这一发现未能明确基因表型和临床表型之间的关联，目前还不适于用于临床基因检测[2]。但NGS通过对人基因库筛选发现致病基因，对推动离子通道病的基因检测与临床应用有重要意义，会成为一种常规基因检测手段。

另外，对LQT2的基因检测又有新发现，Kondo等[3]对1例LQT2研究发现了新的HERG突变A78T，同时对该变异进行热休克(heat shock)干预来检验其稳定性。结果表明A78T-HERG蛋白表达并不稳定，而且使快速延迟整流K通道表达下降。但运用热休克因子-1(heat shock factor-1，HSF-1)干预后A78T-HERG的变异得以恢复。这提示，对A78T-HERG的LQT2病人通过HSF-1靶点干预将会是新的治疗手段。

1.2CPVT的基因检测 截止目前，CPVT共发现3种致病基因，1-2型CPVT分别为RYR2、CASQ2，它们引起肌浆网离子通道钙离子通道蛋白及跨膜蛋白的结构及功能改变[4]，CPVT3型基因位于7p22-p14，但犯罪基因至今仍未明确[5]。RYR2、CASQ2分别为常染色体显性、隐性遗传，以往对它们的研究发现较多。通过NGS技术研究RYR2，发现了诸多变异。近期，Roston等[6]又通过对一个CPVT合并左室致密化不全(LVNC)的多代遗传的家系进行了研究，通过基因检测发现了新的RYR2变异位点(I4855M)，该变异在该家系的两位先证者发现。I4855M可能干扰了Ca2+释放，在野生型RYR2中引起负显性效应，最终通过基因结构及功能检测发现，这一变异为功能缺失变异。他们的研究提示，这一新的RYR2变异可能是CPVT和LVNC的重叠变异。除了以上三种基因变异，Makita等[7]还报道了少见的CPVT致病基因，钙调蛋白表达异常的CALM1、CALM2基因也与CPVT的发生相关。这也提示，CPVT和LQTS存在着重叠致病基因。近期，学者们通过对CALM、TRD进行基因检测发现，它们是CPVT的致病变异，分别为CPVT4、CPVT5[8]。Vega等[9]发现，与LQT7有关的KCNT2变异及与LQT4有关的ANK2变异，可能是CPVT的变异基因亚型，这些证据也表明，CPVT和LQTS存在着很多的基因重叠。

1.3BrS的基因检测 BrS是没有器质性心脏病的常染色显性遗传病。迄今为止，发现多达19种致病基因[10]，这些基因引起钠、钾、钙通道结构或功能改变。以往研究发现，SCN5A是BrS最常见的致病基因。近几年研究发现，单一的SCN5A变异会在同一个体或家系出现多种临床表型，如BrS、LQT3、病窦综合征(SSS)、心脏传导障碍(CCD)，出现所谓的重叠综合征[11]。并且，相同基因型的BrS临床表型可能会出现很大差别，甚至有些患者仅仅通过表现出早复极综合征(ERS)而被识别[11]。以上发现，提示BrS更容易表现出重叠综合征和基因异质性，这或许和BrS的致病基因类型较多，和其他离子通道病基因重叠概率大有关。

1.4JWSs的基因检测 JWSs包括BrS和ERS。目前，与 BrS相关的SCN5A基因变异就超过300个，在BrS和ERS中有很多与SCN5A基因变异相关。SCN5A的功能缺失突变与BrS和ERS都有关系，也与SSS、CCD、Lenegre病有关。当存在显著增大的短暂外向钾电流(Ito)时，功能缺失突变导致INa减低表现为BrS/ERS，否则表现为传导异常[12]。在BrS先证者中发现，13%病人包括下列基因变异：CACNA1C(Cav1.2)、CACNB2b(Cavβ2b)和CACNA2D1(Cavα2δ)。相对罕见基因突变包括：三磷酸甘油脱氢酶1基因(GPD1L)、SCN1B(钠通道的β1亚基)、KCNE3(MiRP2)、SCN3B(钠通道的β3亚 基)、KCNJ8 (Kir6.1)、KCND3(Kv4.3)、RANGRF(MOG1)、SLMAP、ABCC9(SUR2A)、(Navβ2)、PKP2(plakophillin-2)、FGF12(FHAF1)、HEY2和SEMA3A(脑信号蛋白)[13]。最近发现编码钠通道的SCN10A基因突变也可引起BrS。Behr等[14]分析了SCN10A突变及罕见突变的患病率，发现两者具有很高的相关性(5%～16.7%)。这些基因突变引起钠和钙通道电流(INa、ICa)的功能缺失，以及Ito和ATP敏感性钾电流(IK-ATP)的功能获得[14]。另外，最新报道的易感但仍需验证的基因有：瞬时受体电位M通道蛋白-4基因(TRPM4)和KCND2基因[15]。

早期复极样改变(ERP)的心电图改变具有明显家族聚集性。目前已确定的与ERP和ERS都相关的基因变异有7个。另外，在ERS先证者中也发现了L型钙通道(CACNA1C、CACNB2和CACNA2D1)的α1、β2、α2δ亚基，Nav1.5的α1亚基，以及Nav1.8(SCN5A、 SCN10A)的功能缺失突变[13]。

1.5缓慢型心律失常的基因检测 SCN5A在心房肌表达丰富，这在以往已经明确。Baskar等[16]报道过某一SCN5A变异可引起整个心房传导阻滞，从而引起心房静止或SSS，但具体作用机制不明。Chiang等[17]对缓慢型心律失常患者进行回顾性研究发现，功能缺失的SCN5A变异和窦房结功能不良、心房静止及起搏夺获不良相关。以往也有学者报道调控心房钠尿肽(ANP)表达的钠尿肽前体蛋白A(NPPA)基因变异与心房静止有关，这可能与ANP启动第二信使环磷酸鸟苷(cGMP)参与调控离子通道有关，但NPPA变异引起的心房电生理效应仍不清楚[18]。越来越多的证据显示，LMNA、SCN1B、SCN10A、GJA5(Cx40)、KCNJ2、TRPM4、KCNK17等基因变异参与了心脏传导阻滞的发生[18]。

2 基因检测临床应用的评价

2.1LQTS基因检测评价 以往研究发现，在LQTS中KCNQ1基因(LQT1)占30%～35%，KCNH2基因(LQT2)占25%～30%，SCN5A基因(LQT3)占5%～10%，这三种基因占LQTS基因检测阳性病例的90%。虽然其他类型LQTS相关基因<5%，但在LQTS基因检测中仍会遇到假阳性的可能[19]。

另外，在确诊的LQTS中，LQT1～3基因表型和临床表型相关，并且根据临床特点(症状、家族史、心电图)可以推断基因型，这在以往已经明确，对这类明确基因表型和临床表型关联的候选基因进行基因检测更合理[20]。少数的LQTS，其基因型和临床特点并无关联。某些表现出明显临床特点的LQTS患者，其阳性基因检出率只有10%[21]，这在LQT7和LQT8基因检测中更常见[22]。因此，对未能明确基因表型和临床表型有确信关联的致病基因型，并不适合用于临床基因检测。由于LQTS相关基因变异较大，最近有学者[23]试图通过全外显子测序(WES)筛选可疑基因，这或许能揭示LQTS的真实世界数据，但基因序列的高变异性和相关基因的低覆盖率会使这一检测手段的敏感性降低。

2.2CPVT基因检测评价 Makita等[7]报道了CALM1、CALM2基因与CPTV的发生相关。近期，学者们通过对CALM、TRD进行基因检测发现，它们是CPVT的致病变异，分别为CPVT4、CPVT5[8]。Vega等[9]发现，与LQT7有关的KCNT2变异及与LQT4有关的ANK2变异，可能是CPVT的变异基因亚型，这些证据表明，CPVT和LQTS存在着很多的基因重叠。NGS的出现解决了基因测序的问题，但通过NGS无法提高重叠综合征的基因检测特异度。CPVT的基因检测，对合理选择治疗策略(药物、ICD、LCSD、RFCA)有指导意义，但对重叠综合征相关基因进行检测，较低的特异度或许会限制基因检测的临床应用。

2.3BrS基因检测评价 最近的专家共识认为，已在先证者发现BrS致病基因突变者，推荐其家族成员及相关亲属进行该特定突变的检测(Ⅰ类推荐)[24]。BrS发作前心电图正常，晕厥、室性心动过速或心脏骤停可能是首发表现，具有较高的心源性猝死(SCD)风险。有学者认为SCN5A是BrS最常见的致病基因，对此致病进行基因检测，有很强的预测价值。然而，真实世界似乎并非如此。越来越多的研究发现，SCN5A变异似乎并不是BrS的未来心脏事件(晕厥或SCD)的独立预测因子[25]。通过亚组分析发现，和错义的SCN5A变异相比，引起蛋白表达截短(中断或移码)的SCN5A变异中出现了PR、QRS间期延长。通过对中国台湾的汉族人群研究发现，SCN5A变异很可能并不是BrS心律失常复发的预测因子，但可能能够预测心律失常事件的启动时间(数据尚未发布)。对BrS进行基因检测前，必须有能够诊断BrS的临床证据(临床发作史、家族史、心电图)，而且对临床确诊的BrS，不同于LQTS，无论药物或ICD，均不依赖于基因检测指导。基因检测更多是体现在心脏事件复发的预测价值上。以上研究显示，BrS相关基因似乎并非心律失常事件的预测因子，预测价值有限。对临床确诊的BrS，进行基因检测或许并不合适，但对家系中的其他成员检测，对早期发现可疑基因及丰富变异基因位点有一定意义。

尽管目前专家共识推荐BrS1或复杂BrS基因检测有益，但对SCN5A检测发现，仍有2%～5%的正常人群出现了SCN5A稀有变异，这也提示并非所有已知的SCN5A变异必须进行基因检测[26]。此外，根据2012年外显子组排序计划(ESP)提供的数据，与BrS相关的SCN5A变异，在人群中的分布特点仍不清楚。ESP仅仅发现7%(22/300)的SCN5A变异与BrS相关，原先学者们认为的所谓致病变异，只是基于这一变异在正常人群中没有出现。现在来看，这类变异可能本来就罕见或者出现频率很低，单纯归结为致病变异而进行基因检测或许并不合适。此外，很多的BrS变异基因呈不显性表达或变异表达，对此类变异进行合理解释更难，基因检测对此类变异几乎没有什么帮助[27]。

BrS更容易表现出重叠综合征和基因异质性，单一的SCN5A变异会在同一个体或家系出现多种临床表型，如BrS、LQT3、SSS、CCD[11]。虽然NGS通过高通量测序使变异基因的检测更准确全面，但由于重叠综合征的存在，对基因检测的特异度提出了挑战。

2.4JWSs基因检测评价 针对BrS和ERS的众多致病基因，当前仅仅对很小一部分变异进行了功能表达研究，确定了这些变异与疾病的因果关系，阐明了合理的致病机制。学者们运用转基因动物模型进行研究的基因变异也很少，而对BrS或ERS先证者分离的原代心肌细胞或诱导多功能干细胞衍生的心肌细胞的研究更少。通过计算模拟技术有益于预测突变的功能，但至今仍未进行严格测试。Schwartz等[28]强调：缺乏对基因变异的功能学或生物学验证，是基因检测解读中最严重的不足所在。

源于NGS方法的应用，扩大了对一些特异性疾病的认识。 如大几率外显子排序工程(GO-ESP)和外显子组聚集研究(ExAC)，极大地改变了以往关于心脏离子通道病易感基因所谓的“正常”的疾病负担和背景基因变异认知的程度[29]。对BrS患者基因检测发现，18%～28%的患者可检测到SCN5A基因变异，而在普通人群中同样存在3%～5%的“良性” SCN5A基因变异。这表明，对基因检测结果的解释非常复杂。这提示即使是携带最常见致病突变且有典型BrS表型的患者，基因检测出现“假阳性”的概率仍高达10%。目前，已经确定了20余个JWSs易感基因。 这些基因信息仅增加了检测结果解释中总的 “基因学噪音”，并未实质性地增加基因检测中发现真致病突变的机会[30]。以上这些基因检测中存在的问题使我们认识到，以纯粹的概率论来解读JWSs基因检测的结果很有必要，但却不能据此得出是否有病或确诊疾病的结论。

3 小结

近30年，离子通道病的基因检测取得了辉煌的成就。尽管更加先进的DNA测序技术应用于离子通道病的基因检测中，使基因结构和功能复杂的离子通道病得以明确，但NGS基因检测技术应用于临床实践仍面临挑战。NGS筛选多致病基因的同时，不可避免的纳入了有意义的不确定罕见变异(VUS)，并增加了后续基因功能研究的难度。尽管有这些技术的帮助， 基因检测中发现的大量基因变异仍成为我们被迫面对的“基因学炼狱”，这些变异的数目也会随着外显子或基因学测序的广泛应用而更趋增多。这就要求建立一个包含有临床确诊和变异分级证据相关的基因变异数据库。这样或许更能推动离子通道病的基因检测，至少现阶段，离子通道病基因检测的潘多拉盒子仍未打开。

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