不同蛋白酶对天龙粉水解作用的比较研究

王 颖 王立娜 刘春雨 王 静 黄志强 张由芹 朱明珠 蔡梅超

(山东中医药大学药学院，山东 济南 250355)

天龙别名壁虎、守宫，为壁虎科动物无蹼壁虎(GekkoswinhonisGunther)等的全体[1]，味咸性寒，具有祛风定惊、散结解毒、通络止痛等功效。近代研究表明，天龙具有抗肿瘤的作用，壁虎中主要含有与马峰毒相似的有毒物质以及组织胺类和蛋白质类成分。现代药理研究表明,动物类药材发挥作用的主要为其小分子肽[2～4]，动物药在酶解之后其生物活性普遍高于原品[5～7]。顾响响[8]等研究表明，鲜壁虎酶解后增加了鲜壁虎粗提物对小鼠H22移植瘤的抑制作用。

本文以天龙冻干粉为底物，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和木瓜蛋白酶5种蛋白酶进行水解，同时以水提天龙粉作为对照组，测定每种蛋白酶的水解度，评价5种蛋白酶对天龙粉的水解效果，为天龙抗肿瘤活性成分及天龙加工方法的改进提供新思路，为临床用药提供新途径。

1 实验材料

1.1 试剂

胰蛋白酶、 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、甘氨酸(国药集团化学试剂有限公司)；胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶( 上海源叶生物科技有限公司)；茚三酮、果糖、邻苯二甲酸氢钠、磷酸二氢钾、盐酸、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、0.1 mol/l 盐酸标准滴定溶液40%氢氧化钠溶液、4%硼酸溶液；所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水。

1.2 仪器

KDN-2C 定氮仪配四孔消化炉( 上海纤检仪器有限公司)；PHS-25型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司； UV9100B 可见分光光度计( 北京莱伯泰科仪器有限公司)等。

1.3 药材

天龙购自安徽亳州市，天龙粉为冷冻干燥天龙粉，批号为20150801。

2 方 法

2.1 天龙粉水解液的制备

称取天龙冻干粉6份，每份精密称取1.000 0 g，分别加入250 mL具塞锥形瓶中，按料液比1∶30加入定量蒸馏水，超声提取30 min，按表1进行实验。分别得到6种天龙粉酶解粗液，然后分别在3 000 r/min条件下，离心10 min，抽滤，定容至100 mL，得最终天龙酶解液。

表1 5种蛋白酶的水解条件Table 1 Hydrolysis conditions of five kinds of protease

2.2 茚三酮显色法测定蛋白质的水解度

2.2.1标准曲线的绘制

精密称取茚三酮0.5 g，磷酸氢二钠10 g，果糖0.3 g，磷酸二氢钾6 g，用40%乙醇溶液，定容至100 mL，即得茚三酮显色剂。

精密称取干燥过的甘氨酸0.100 0 g，加蒸馏水溶解后定容至100 mL，然后再取出2 mL定容到100 mL容量瓶中,即得 20 ug/mL 的溶液，分别量取0、1、2、3、4、5 mL定容到10 mL的容量瓶中,再分别从各稀释液取2 mL于试管中，加入1.00 mL显色剂，混匀，在沸水浴中加热15 min，在冷水中迅速放凉，各加入5 mL40%乙醇溶液，混匀后，放置15 min,在570 nm处用分光光度计测定吸光度A，绘制标准曲线。

2.2.2样品中游离氨基酸含量测定

将6种天龙粉水解液适量定量，按照一定的稀释倍数稀释到适宜的浓度，按照“2.2.1”方法测定样品的吸光度A，并计算样品中游离氨基酸的含量。

2.3 水解度的测定

用茚三酮法测定水解液中的游离氨基肽氮含量，用凯氏定氮法测定原料中总氮量，按照下式计算水解度。

式中：A：料中的总氮数；B：水解液中的氨基氮数；C：原料中游离的氨基氮数。

3 结果与分析

3.1 氨基肽氮含量的测定

3.1.1标准曲线的绘制

以吸光度为横坐标，以甘氨酸标准溶液的-NH2浓度(μg/mL)为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：Y=4.978X-0.028，相关系数r2=0.9984。

3.1.2样品中氨基肽氮的含量测定结果

如表2所示。

表2 水解液中的氨基肽氮含量Tabke 2 Content of amino nitrogen in Hydrolysate

3.2 样品的水解度测定结果

用凯氏定氮法测定1.000 0 g原料中总氮的含量为21.679 mg/mL。根据公式计算出四种蛋白质的水解度，结果如图1所示，弹性蛋白酶的水解能力最高，DH为73.18%，胃蛋白酶的水解度为76.33%，木瓜蛋白酶的水解度为57.34%，胰凝乳蛋白酶的水解度较低，DH为34.05%。胰蛋白酶的水解度最低，DH为29.68%。

图1 五种蛋白酶的水解度Fig 1 Hydrolysis degree of five kinds of proteases

4 讨 论

本研究利用五种不同的酶将天龙粉酶解，其中经弹性蛋白酶和胃蛋白酶酶解后的水解度较高，木瓜蛋白酶的水解度次之，而胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶的水解度较低。这是不同种类的酶具有不同的酶切位点。胃蛋白酶是胃中主要消化的蛋白酶，能够水解芳香族或其他疏水氨基酸的羧基或氨基形成的肽键；弹性蛋白酶具有广泛的水解活性对明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质都有降解作用，是一种广谱的肽链内切酶[9]，能够水解丙氨酸、甘氨酸及短脂肪链氨基酸的羧基形成的肽键；胰蛋白酶是小肠中主要消化的蛋白酶，只是专一地水精氨酸、解赖氨酸羧基形成的肽键；胰凝乳蛋白酶是专一地水解由芳香族氨基酸或带有较大非极性侧链的氨基酸羧基形成的肽键；木瓜蛋白酶是食品工业中常用的蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中的L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽链。

很多研究表明，动、植物中的小分子肽具有很好的抗肿瘤效果。有研究表明，某些动物药经酶解后释放出活性多肽，表现出更强的生物活性，因此，从动物药酶解产物中发掘出高效低毒的活性多肽，可能是新药发现的一条新途径。本研究考察不同酶对天龙粉的酶解效果，以水解度为评判指标，可以为下一步药理实验探究天龙不同酶解物的抗肿瘤效果，提供参考，也可以为下一步天龙抗肿瘤活性成分及天龙加工方法的改进提供新思路，为临床用药提供新途径。

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