手掌参多糖延缓衰老作用的研究

余培芝,韩鸿萍,尚 军,陈 志

(青海师范大学,青藏高原药用动植物资源重点实验室,西宁 810008)

手掌参别名手参、佛手参、阴阳草、手儿参等,藏药名为旺拉,系兰科手参属多年生草本植物手掌参(Gymnadeniaconopsea)的块茎。手掌参是蒙医常用的中药材,在多部典籍中有记载[1-3],具有补气养血、活血止痛、益肾健脾等多种功效。目前关于手掌参的药理活性研究较少,而植物多糖是大多药用植物的主要活性物质,在抗衰老、抗氧化、免疫调节和抗肿瘤等[4-7]方面发挥着重要功能,是近年来研究的热点。本实验用D-半乳糖制备小鼠亚急性衰老模型[8],探讨手掌参多糖延缓衰老的可能机制,以期为手掌参多糖的开发利用提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1仪器 Eppendorf AG 22331 Hamburg高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；UV-1800型紫外分光光度计(日本岛津公司)；xMark BIO-RAD酶标仪(BIO-RAD公司)；MB100-4P微孔板孵育器(金坛市盛蓝仪器制造有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；可调移液器(上海荣泰生化工程有限公司)。

1.2试药 D(+)-半乳糖(上海中秦化学试剂有限公司)；天然维生素E软胶囊(山东圣海保健品有限公司)；总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒、过氧化氢酶(CAT)测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒和BCA法蛋白定量测试盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3动物 昆明种小鼠,由兰州大学医学院实验动物中心提供。

2 方法

2.1手掌参多糖的制备 手掌参来源于青海省果洛藏族自治州,经陈志教授鉴定为兰科植物手掌参(Gymnadeniaconopsea)的干燥块茎。手掌参经干燥、粉碎,过60目筛,石油醚脱脂,乙醇除杂,水提醇沉,除蛋白,醇沉,用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤,真空干燥等程序,得手掌参多糖,质量分数达89.80%。

2.2实验动物分组、造模及给药方法 昆明种小鼠,6周龄,体质量为18～22 g,雌雄各半,共60只。实验室适应1周后按体质量随机分为6组,分别为空白对照组,衰老模型组,阳性对照组和手掌参多糖高、中、低剂量组。每组10只,自由饮食和饮水,每5 d称定1次体质量。第1～10天,空白对照组每日颈背部皮下注射生理盐水10 mL·kg-1·BW-1,灌胃等体积生理盐水；衰老模型组,阳性对照组和手掌参多糖高、中、低剂量组每日颈背部皮下注射0.5 g·kg-1D-半乳糖溶液,灌胃生理盐水10 mL·kg-1·BW-1。从第11 天开始,空白对照组每日颈背部皮下注射生理盐水10 mL·kg-1·BW-1,灌胃等体积生理盐水；衰老模型组,阳性对照组和手掌参多糖高、中、低剂量组,分别灌胃生理盐水10 mL·kg-1·BW-1、21.6 mg·kg-1维生素E溶液以及0.20,0.10和0.05 g·kg-1手掌参多糖溶液,并同时颈背部皮下注射0.5 g·kg-1D-半乳糖溶液。连续给药60 d。

2.3生化指标测定 末次给药24 h后摘取眼球取血,血液4 ℃静置,待析出血清后以3 000 r·min-14 ℃离心15 min,在-80 ℃保存上清液。迅速取肝脏、全脑,用4 ℃生理盐水漂洗,除去血液和结缔组织,用滤纸拭干,称定质量,计算小鼠脏器指数,脏器指数(%)=脏器质量(g)/小鼠体质量(g)×100%。分别取部分肝脏和全脑,称定质量,按照质量∶体积=1∶9的比例,加入9倍体积的4 ℃生理盐水制成肝匀浆和脑匀浆,即得质量分数为10%的组织匀浆。血清、肝组织和脑组织中T-SOD、CAT、GSH-PX活性及MDA含量按照试剂盒说明书进行操作。

3 结果与分析

3.1小鼠体质量和肝脏指数的测定结果 实验结果显示,与衰老模型组比较,空白对照组、阳性对照组和手掌参多糖高剂量组体质量均明显增加(P<0.01),手掌参多糖中、低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。与衰老模型组比较,空白对照组和阳性对照组肝脏指数均显著提高(P<0.01),手掌参多糖高剂量组肝脏指数显著提高(P<0.05),手掌参多糖中、低剂量组肝脏指数差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1多糖对小鼠体质量和肝脏指数的影响

Tab.1 Effects of polysaccharide on body weight and liver index in mice (n=10)

注：与衰老模型组比较*P<0.05,**P<0.01。

3.2血清中T-SOD、CAT和GSH-PX的活性以及MDA含量的测定结果 实验结果显示,空白对照组血清中的T-SOD、CAT和GSH-PX活性均大于衰老模型组(P<0.01),MDA含量则小于衰老模型组(P<0.01)。阳性对照组与衰老模型组比较,血清T-SOD(P<0.05)、CAT(P<0.05)和GSH-PX(P<0.01)活性均显著提高,而MDA含量降低(P<0.01)。手掌参多糖高剂量组与衰老模型组比较,血清T-SOD(P<0.05)、CAT(P<0.01)和GSH-PX(P<0.05)活性均显著提高,而MDA含量下降(P<0.05)。手掌参多糖中、低剂量组与衰老模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

3.3肝组织中T-SOD、CAT和GSH-PX活性以及MDA含量的测定结果 实验结果显示,空白对照组肝组织中T-SOD、CAT和GSH-PX活性均大于衰老模型组(P<0.01),而MDA含量小于衰老模型组(P<0.01)。阳性对照组与衰老模型组比较,T-SOD(P<0.01)、CAT(P<0.05)和GSH-PX(P<0.05)活性均显著提高,MDA含量降低(P<0.05)。手掌参多糖高剂量组与衰老模型组比较,T-SOD(P<0.01)、CAT(P<0.05)和GSH-PX(P<0.05)活性均显著提高,MDA含量下降(P<0.01)。手掌参多糖中、低剂量组与衰老模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2多糖对小鼠血清中T-SOD、CAT和GSH-PX活性以及MDA含量的影响

Tab.2 Effects of polysaccharide on the activities of T-SOD,CAT,GSH-PX and the content of MDA in serum of mice (n=10)

注：与衰老模型组比较*P<0.05,**P<0.01。

表3多糖对小鼠肝组织中T-SOD、CAT、GSH-PX和MDA含量的影响

Tab.3 Effects of polysaccharide on the activities of T-SOD,CAT,GSH-PX and the content of MDA in liver tissue of mice (n=10)

注：与衰老模型组比较*P<0.05,**P<0.01。

3.4脑组织中T-SOD、CAT和GSH-PX活性以及MDA含量的测定结果 实验结果显示,空白对照组的脑组织T-SOD、CAT和GSH-PX活性均大于衰老模型组(P<0.01),MDA含量低于衰老模型组(P<0.01)。阳性对照组与衰老模型组比较,T-SOD、CAT和GSH-PX活性均显著提高(P<0.01),MDA含量降低(P<0.01)。手掌参多糖高剂量组与衰老模型组比较,T-SOD(P<0.05)、CAT(P<0.05)和GSH-PX(P<0.01)活性均显著提高,MDA含量下降(P<0.01)。手掌参多糖中、低剂量组与衰老模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4多糖对小鼠脑组织中T-SOD、CAT和GSH-PX活性以及MDA含量的影响

Tab.4 Effects of polysaccharide on the activities of T-SOD,CAT,GSH-PX and the content of MDA in brain tissue of mice (n=10)

注：与衰老模型组比较*P<0.05,**P<0.01。

4 讨论

小鼠衰老模型的建立方法主要有以下4种：自然衰老法、D-半乳糖注射法、臭氧损伤法和胸腺摘除法[8]。D-半乳糖注射法因其价格低廉、操作简便、结果稳定而广泛应用于各种与衰老相关的实验中[9-11]。衰老代谢学说认为[8],长期给动物注射D-半乳糖,会使机体细胞内D-半乳糖质量浓度上升,在糖醛还原酶作用下还原成细胞不能继续代谢的半乳糖醇,影响正常渗透压,导致机体代谢发生紊乱,氧化防御系统遭到破坏,大量自由基和超氧阴离子、过氧化脂质等集聚,引起机体衰老。

体质量是动物实验中非常重要的指标之一,能反映机体综合代谢和体能[18]。本实验衰老模型组体质量减轻,可能与D-半乳糖所致的代谢紊乱有关。脏器指数是实验动物重要的生物指标之一,其大小能在一定程度上反映器官功能的强弱[19]。肝脏是人体重要的生命器官,在机体代谢、免疫和胆汁生成等方面起着重要作用,因此检测实验动物的肝脏指数能更好地评价机体状态。

本实验中,手掌参多糖高剂量组能显著提高衰老小鼠血清、脑组织和肝组织中T-SOD、CAT、GSH-PX活性(P<0.01,P<0.05),降低MDA含量(P<0.01,P<0.05),增加衰老小鼠体质量(P<0.01),还能显著提高衰老小鼠肝脏指数(P<0.05),结果表明,本实验成功复制了D-半乳糖亚急性衰老模型。

综上所述,手掌参多糖能通过提高机体T-SOD、CAT和GSH-PX等抗氧化酶活性,降低MDA含量和增加免疫器官指数而延缓小鼠的衰老进程。

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