木瓜蛋白酶复合剂抑制淮山酶促褐变的应用

谢冬娣， 李丹梅， 龚振维

(贺州学院食品与生物工程学院，广西贺州 542899)

鲜切果蔬保持了果蔬原有的新鲜状态，又经过了加工而使产品清洁卫生，是满足现代都市人快速生活节奏的一种果蔬加工方式。淮山(Yam)为薯蓣科薯蓣属薯蓣的根茎，别称怀山药、淮山药，是药食同源的蔬菜。鲜切淮山在加工和贮藏中极易产生褐变，严重影响其外观，不利于销售。目前对鲜切淮山褐变的控制主要采用物理方法[1-4]，也常使用化学护色方法[5-7]，但有一定局限性，极少有使用生物酶法的报道。由于木瓜蛋白酶已经被证实对抑制酶促褐变有显著效果[6-8]，但目前却尚未有将其用于抑制鲜切淮山褐变的研究。笔者将木瓜蛋白酶结合抗坏血酸(AA)、氯化钠(NaCl)以及柠檬酸(CA)，以单一抑制剂对淮山褐变控制效果的研究为基础，采用正交试验优化，研究安全环保的木瓜蛋白酶复合抑制剂对鲜切淮山酶促褐变的影响，以期探索生物酶法在淮山鲜切加工中的应用，为鲜切淮山加工贮藏生产实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及主要药品

主要材料：贺街淮山，为国家地理标志保护产品；保鲜袋；木瓜蛋白酶 (酶活性100万U)。抗坏血酸、氯化钠、柠檬酸、邻苯二酚、H2O2、愈创木酚，以上药品均为分析纯。

1.2 试验处理方法

挑选外皮完好、无病害、无机械损伤的淮山，切成厚度为3～4 mm的斜片[2]，然后用不同浓度的抑制剂浸泡处理1 h，晾干表面处理液后，平铺装入保鲜袋中，置于5 ℃冷藏库贮藏。抗坏血酸浓度设为0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%。氯化钠浓度设为0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%。柠檬酸浓度设为0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%。木瓜蛋白酶浓度设为0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%。设不浸泡处理为对照组。试验观察贮藏期5 d，第5天检测淮山的多酚氧化酶(PPO)活性、过氧化物酶(POD)活性、褐变度(BD)等指标。试验设3个重复。

在单一抑制剂单因素试验基础上，筛选出抑制褐变效果明显的3个因素及其浓度水平，进行正交试验，确定各种抑制剂与木瓜蛋白酶的最佳组合。正交试验各因素浓度水平设计见表1。

表1 各因素浓度水平

1.3 指标检测方法

褐变度的测定：采用吸光度法，将样品直接打碎，取适量样品按体积比1 ∶10添加蒸馏水，低温下匀浆2 min，过滤后取滤液于25 ℃保温5 min，在波长410 nm处测定其吸光度，重复3次，以D410 nm×10表示褐变度。褐变度越高，表示褐变越严重。

多酚氧化酶活性测定：采用邻苯二酚法[9]，以 1 min 内吸光度变化0.01为1个酶活性单位，单位U/mL。过氧化物酶活性测定：采用愈创木酚法[9]，以1 min内吸光度变化0.01为1个酶活性单位，U/mL。

2 结果与分析

2.1 柠檬酸抑制鲜切淮山酶促褐变效果

2.1.1 柠檬酸处理对淮山褐变度的影响 图1显示，在5 ℃的冷藏条件下，鲜切淮山经过不同浓度柠檬酸处理，其褐变度BD值均低于对照组。其中，在0.25%～0.40%柠檬酸浓度范围内，随着柠檬酸浓度增大，淮山的BD值一直呈现下降趋势；柠檬酸浓度为0.40%时的BD值最低，与对照组差异最大；而在柠檬酸浓度为0.45%时淮山的BD值较高，但仍低于对照组。结果表明，柠檬酸处理浓度在0.40%时，对鲜切淮山的褐变抑制效果较好。

2.1.2 柠檬酸处理对淮山PPO、POD活性的影响 图2显示，鲜切淮山经过不同浓度柠檬酸处理，其多酚氧化酶活性均明显比对照组低，即表明柠檬酸能抑制鲜切淮山的PPO活性。原因可能是柠檬酸处理既调节反应体系pH值，又对PPO的辅基起到螯合作用[6]，从而抑制PPO活性。当柠檬酸浓度为0.30%～0.45%时，各处理组淮山PPO活性差异不明显，其中0.35%浓度处理的淮山PPO活性最低，与0.25%浓度处理的差异较大。表明浓度为0.35%的柠檬酸抑制PPO活性效果比较明显。图2也显示，在柠檬酸浓度试验范围内，各处理组淮山的多酚氧化物酶活性均比对照组低，但不明显；各处理组淮山POD活性差异也不明显，即表明柠檬酸能较好地抑制鲜切淮山的PPO活性，但不能很好地抑制鲜切淮山的POD活性，这类似于李红涛等研究的柠檬酸不能有效抑制淮山贮藏期间POD活性的结果[7]。

2.2 抗坏血酸抑制鲜切淮山酶促褐变效果

2.2.1 抗坏血酸处理对淮山褐变度的影响 从图3可以看出，鲜切淮山经不同浓度抗坏血酸处理，除浓度为0.3%的处理外，其余浓度的抗坏血酸溶液处理的淮山的褐变度(BD值)均比对照组的低。原因可能是因为抗坏血酸作为醌还原剂，阻止醌类物质进一步自发聚合形成色素物质[6]。其中，浓度为 0.10%、0.15%、0.20%抗坏血酸处理的BD值差异不明显，而0.25%抗坏血酸处理的淮山的BD值最低，与对照组、0.30%处理组差异明显，说明0.25%抗坏血酸对淮山褐变抑制效果较好。

2.2.2 抗坏血酸处理对淮山PPO、POD活性的影响 从图4可以看出，不同浓度的抗坏血酸处理的鲜切淮山POD活性均比对照组的低。从0.10%浓度处理开始逐渐下降，到0.20%浓度处理降到最低点，之后，随着抗坏血酸处理浓度的升高，淮山的POD活性逐渐升高。结果表明，在一定范围内，淮山POD活性随着AA浓度增加而降低，之后随着浓度增加而升高。其中0.20%抗坏血酸溶液对淮山POD活性抑制效果较好。经过抗坏血酸处理的淮山的PPO活性也都比对照组的低，但是波动较大，在0.15%、0.20%浓度处理时分别达到最低、最高的PPO活性。这可能是由于抗坏血酸虽有金属螯合作用，但是同时抗坏血酸也具有还原性、氧化性，能将氧化的醌还原为酚类物质而抑制褐变，但其本身比酚类物质更易于氧化褐变[7]。

2.3 木瓜蛋白酶抑制鲜切淮山酶促褐变效果

2.3.1 木瓜蛋白酶处理对淮山褐变度的影响 蛋白酶可导致一些促进褐变的酶系失活，从而抑制褐变的发生[6]。从图5可以看出，经不同浓度木瓜蛋白酶处理的淮山的BD值大部分比对照组的低，表明木瓜蛋白酶对于控制淮山的褐变度有一定的效果，但是在低浓度时效果不明显，其中0.20%浓度的木瓜蛋白酶抑制淮山褐变的效果最明显。

2.3.2 木瓜蛋白酶处理对淮山PPO、POD活性的影响 从图6可以看出，经过不同浓度木瓜蛋白酶处理的鲜切淮山的PPO、POD活性均比对照组的低。原因可能是由于木瓜蛋白酶与醌类物质偶联中断醌聚合，或与PPO、POD的辅基螯合而抑制了酶的活性[6]。在处理浓度0.10%～0.25%范围内，PPO、POD活性随木瓜蛋白酶浓度增大而降低；在处理浓度在大于 0.25% 之后有升高的趋势。结果表明，0.25%木瓜蛋白酶浓度处理对淮山PPO、POD活性的抑制效果较好。

2.4 氯化钠抑制鲜切淮山酶促褐变效果

2.4.1 NaCl处理对淮山褐变度的影响 由图7可以看出，在处理浓度0.5%～0.8%范围内，经NaCl处理的鲜切淮山的BD值随着NaCl溶液浓度的增加而逐渐升高，且大部分都高于对照组，表明NaCl溶液不能很好地保持淮山的感官特质，而且随着浓度的增加，效果越来越差。

2.4.2 NaCl处理对淮山PPO、POD活性的影响 NaCl可以通过降低果蔬表面的氧溶解度而抑制PPO的氧化作用，亦或是使褐变酶发生盐析作用，从而抑制褐变[1]。由图8可以看出，经过不同浓度NaCl处理的鲜切淮山的PPO活性基本上比对照组的低，在NaCl处理浓度为0.5%～0.8%范围内，鲜切淮山POD活性均比对照组的低，但差异均不明显，其中 0.5% 浓度NaCl处理的淮山PPO活性最高，并且达到对照组水平；随着处理浓度的升高，淮山PPO活性逐渐下降，但是下降缓慢。0.4%浓度处理的淮山POD活性最高，超过对照组水平。试验结果表明，NaCl溶液对鲜切淮山的PPO、POD活性有一定的抑制作用，但是效果均不明显。

2.5 复合因素处理抑制鲜切淮山褐变的结果与分析

根据“2.1”至“2.4”节的结果分析，柠檬酸、抗坏血酸和木瓜蛋白酶单一处理的鲜切淮山各项指标都比对照组的好，表明其抑制鲜切淮山褐变的效果比较好；而经过NaCl溶液处理的鲜切淮山各项指标与对照组很接近，有些比对照组差。因此选择柠檬酸、抗坏血酸和木瓜蛋白酶作为正交试验的因素。

根据图1至图8的数据进行综合分析，由于引起淮山褐变的酶主要是PPO，所以在用褐变抑制剂处理鲜切淮山时，以PPO活性作为首要指标来判断各浓度抑制剂防褐变效果的强弱，以其他2项指标作为辅助指标，每个因素选择3个浓度水平(表1)进行正交试验。试验的结果与分析分别见表2、表3。

从表3可以看出，在BD值、PPO活性、POD活性方面，A是主要因素；在BD值、PPO活性方面，C是次主要因素，B是次要因素；在POD活性方面，B是次主要因素，C是次要因素。综合考虑可知，3个因素对3个指标影响的主次顺序为A﹥C﹥B。因素A、因素C的水平按“少数服从多数”原则分别选择A3、C2。因素B对3个指标的影响水平各不相同，难以选择。因此，对组合A3B1C2、A3B2C2、A3B3C2进行验证试验。验证结果中，A3B2C2组合(柠檬酸浓度0.40%、抗坏血酸浓度0.20%、木瓜蛋白酶浓度0.20%)最优，获得BD值0.194、PPO活性0.21 U/mL、POD活性9.2 U/mL的抑制褐变效果。

表2 复合抑制剂正交试验结果

表3 复合抑制剂正交试验结果分析

3 讨论与结论

本试验遵循降低酸度、金属螯合作用、醌还原作用、醌偶联作用等褐变控制机制，探讨冷藏(5 ℃)条件下鲜切淮山酶促褐变的控制措施。有关研究表明，鲜切果蔬的褐变主要是酶促褐变，大多认为与酚类物质含量和PPO活性密不可分[1，10-11]，淮山多酚氧化酶的最适pH值=6.0[12]，那么降低介质中的pH值，可以控制酚酶的活性，抑制其催化作用。通常通过添加酸控制pH值使酚酶的活性丧失[6]。PPO、POD都是以金属离子作为辅基的一种蛋白质，它能被金属鳌合物所抑制。柠檬酸是良好的酸化剂，除了通过调节反应体系pH值来抑制褐变外，其结构中的3个羧基还可以对金属离子起到较强的螯合作用[6]。而抗坏血酸既有金属螯合作用，也可作为醌还原剂，从而清除自由基和活性氧，将氧化的醌还原为酚类物质[3]。木瓜蛋白酶属于巯基蛋白酶，活性中心含半胱氨酸，可以作为醌类偶联剂，能与醌类物质形成无色的复合物，从而中断醌类物质聚合形成色素物质；同时木瓜蛋白酶可以通过与PPO、POD活性位点的金属离子不可逆结合而抑制褐变相关酶的活性[6]。为了达到良好防褐变效果，单一抑制剂长期使用或者高浓度使用会带来成本高、危害健康等问题。因此，多种抑制剂复合使用可起到协同增效作用，既可以避免以上问题，也可成为鲜切淮山加工及贮藏过程中的防褐控制方向。

本研究发现，鲜切淮山极易褐变，与相关报道有相同的结论。在试验过程中发现单独用柠檬酸或抗坏血酸处理鲜切淮山时，在PPO活性、POD活性这2个指标中，不同浓度影响酶活性强弱的顺序差别较大。这可能是由于抗坏血酸虽然是一种PPO活性抑制剂，但作为抗氧化剂，它比酚类物质更易氧化褐变，故不宜单独用于防止淮山褐变；而柠檬酸、植酸、氯化钙等复合剂仅对PPO活性有抑制作用，在鲜切淮山贮藏期间还会使POD活性有所提高[7]。

综上试验结果表明，柠檬酸、抗坏血酸和木瓜蛋白酶抑制鲜切淮山的褐变具有较好的效果，而NaCl溶液对于防止鲜切淮山的褐变效果不明显；采用柠檬酸、抗坏血酸和木瓜蛋白酶进行正交试验所筛选的最佳抑制剂组合为0.40%柠檬酸+0.20%木瓜蛋白酶+0.20%抗坏血酸，各抑制剂作用主次顺序为柠檬酸>木瓜蛋白酶>抗坏血酸。本试验将木瓜蛋白酶用于鲜切淮山褐变控制是首例，其效果接近柠檬酸和抗坏血酸，优于氯化钠，说明其效果较好，值得推广。

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