新疆地区梨树与白杨树腐烂病病菌的交叉侵染

2018-01-12赵延存孙连波钱国良刘凤权

江苏农业科学 2017年24期

赵延存，刘坤，，孙连波，钱国良，刘凤权，

(1.江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏南京 210014； 2.南京农业大学植物保护学院，江苏南京 210095)

梨是我国第三大水果，种植范围广，我国梨树栽培面积约108.5万hm2，产量达1 579.5万t，约占世界总产量的 2/3[1-2]。梨树腐烂病又称烂皮病，是梨树上危害最严重的枝干病害，在我国各地梨园均有发生，特别是新疆、西北、华北和东北产区发生危害较严重，对我国梨产业的健康发展构成严重的威胁[3]。库尔勒香梨是新疆库尔勒地区的优质特色地方梨品种，因其品质佳而远销国内外。然而，近年来梨树腐烂病危害严重，许多香梨园中梨树腐烂病病株率高达100%，90%的梨树死亡植株是由腐烂病危害所致，严重制约了香梨产业的健康发展[4-5]。

在新疆地区，白杨树常作为防护林栽种于梨园四周，白杨树腐烂病也发生危害较严重。在病害调研过程中，发现白杨树腐烂病症状与梨树腐烂病症状极为相似，因此推测这2种树木上的腐烂病病菌可能存在交叉侵染现象。已有研究表明，白杨树腐烂病病菌可以危害苹果树、梨树等[6-7]，苹果树和梨树腐烂病病菌也可以危害杨树[8-10]。为验证香梨腐烂病病菌和白杨树腐烂病病菌的交叉侵染，分别采集了香梨树及白杨树腐烂病的样品，对病原菌进行分离鉴定，并进行交叉接种侵染试验，以确定香梨腐烂病的侵染源，为新疆香梨腐烂病的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料库尔勒香梨树的腐烂病样品以及种植于梨园周围白杨树的腐烂病样品，均采自新疆库尔勒地区。

1.1.2 接种材料库尔勒香梨枝条、叶片、果实，白杨树枝条。

1.1.3 培养基马铃薯蔗糖培养基(PDA)：200 g去皮马铃薯，切成小块，加20 g琼脂，1 000 mL水煮沸30 min，4层纱布过滤，滤液中加入20 g蔗糖，用水补足1 000 mL。

1.1.4 引物采用ITS通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′对菌株的总DNA进行rDNA-ITS序列扩增。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离与鉴定采用组织分离法，从病斑的病健交界处取样，置于PDA平板上，28 ℃黑暗培养，待组织周围长出真菌菌丝，从边缘处打孔，将菌丝块移植于新的PDA平板上，并对其进行编号。利用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA)提取每个菌株的总DNA，然后利用ITS通用引物ITS1/ITS4进行rDNA-ITS序列扩增，将PCR产物进行电泳检测及测序，并将序列在NCBI数据库中进行Blast比对分析。

1.2.2 病原菌的验证试验依据柯赫氏法则，采用打孔法，首先选取粗细相同的枝条，消毒后截成15 cm长的小段，上端用石蜡封口，然后用直径为0.8 cm的打孔器在树枝上打孔，将菌丝块长满菌丝的一面紧贴伤口部位，以只接种PDA培养基作为空白对照，然后用封口膜将伤口部位包扎好，将枝条插入灭菌的湿沙盘中，置于28 ℃培养箱中进行12 h光照/12 h黑暗培养，接种5 d后测量病斑长度，每个病菌重复3次。将从梨树上的分离物回接梨树枝条，同时将从白杨树上的分离物回接白杨树枝条，观察其发病情况，并从发病部位再次分离病原菌，并对其进行分子鉴定。

1.2.3 病原菌的交叉侵染试验采用打孔法将梨树上的分离物接种于白杨树枝条，同时将白杨树上的分离物接种于梨树枝条，观察其能否产生交叉侵染现象，并对发病部位再次进行病原菌的分离和鉴定。

1.2.4 病原菌在梨树上的致病性研究将白杨树上分离得到的病原物通过打孔法接种于梨树枝条和梨果实上，并通过针刺法接种于梨树叶片，观察发病情况。统计病原菌在梨果实上发病6 d后的病斑大小。将白杨树上的分离物在梨果实上继代接种3代，即不断从发病部位分离病原菌并再次接种，观察各代病原菌的致病性变化情况。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离与鉴定

从梨树样品中共分离得到23株疑似病原菌的菌株，从白杨树样品中共分离得到35株疑似病原菌的菌株，将这些菌株进行rDNA-ITS测序，并将序列在NCBI数据库中进行Blast比对，发现梨树样品分离物中有8株菌株与梨腐烂病病菌具有较高的同源性，而白杨树样品分离物中有11株菌株与白杨树腐烂病病菌有较高的同源性，另有9株菌株与柳树腐烂病病菌有较高的同源性，同源性均高于99%。再结合培养性状观察，最终将这些菌株分别鉴定为梨树腐烂病病菌(Valsamalivar.pyri)、白杨树腐烂病病菌(Valsasordida)、柳树腐烂病病菌(Cytosporatranslucens)。

2.2 病原菌的形态学观察

3种腐烂病病菌的培养性状如图1所示，A1、B1、C1分别为梨树、白杨树、柳树腐烂病病菌培养5 d后的菌落形态，其中梨树腐烂病病菌菌落呈白色，菌丝气生性较弱，紧贴着培养基生长；白杨树腐烂病病菌菌落呈橘红色，菌丝气生性较强，呈丝状，不紧贴培养基生长；柳树腐烂病病菌菌落呈褐绿色，菌丝的气生性也较弱，紧贴着培养基生长。A2、B2、C2分别为梨树、白杨树、柳树腐烂病病菌培养 15 d 后的菌落形态，可以看出3种菌株均已产生分生孢子器，突起于培养基上方，其中梨树腐烂病病菌的分生孢子器呈墨绿色，较大；白杨树及柳树腐烂病病菌的分生孢子器呈白色，白杨树腐烂病病菌的分生孢子器较大也比较密集，柳树腐烂病病菌的分生孢子器较小，且比较稀疏。

2.3 病原菌的回接验证及交叉侵染试验

将梨树、白杨树和柳树腐烂病病菌分别回接到各自寄主的枝条上，发病率分别为100.0%、73.7%、56.3%(表1)，其病害症状如图2所示，与所采集样品的病害症状相似。从发病部位再次分离病菌，进行形态学及分子鉴定，结果证实分离物与接种的病原菌相同，依据柯赫氏法则证明从所采集样品上获得的分离物即为这2种枝条的致病菌。

将已验证的病原菌进行交叉侵染试验，即选取梨树腐烂病病菌接种白杨树枝条，再选取白杨树、柳树腐烂病病菌接种梨树枝条，观察交叉接种后的发病情况。由表1可知，白杨树、柳树腐烂病病菌接种到梨树枝条后发病率分别为 45.8%、63.0%，而梨树腐烂病病菌接种白杨树枝条后发病率仅为 8.9%。从以上枝条的发病部位再次分离病菌，并进行形态及分子鉴定，结果证实分离物与接种的病原菌相同，说明这些病原菌之间可以交叉侵染。

表1 病原菌回接梨树、白杨树枝条的发病率

2.4 病原菌在梨树上的致病性研究

为研究白杨树上的腐烂病病菌对梨树的危害，将其与梨树腐烂病病菌一起接种于梨树，观察致病情况。将3种病原菌接种于梨树枝条，由梨树、白杨树、柳树腐烂病病菌引起的发病率分别为100.0%、45.8%、63.0%；将3种病原菌接种梨树叶片，发病率分别为100.0%、6.7%、44.4%，且柳树、白杨树腐烂病病菌在梨树叶片上引起的病斑较小(图3)；将3种病原菌接种于库尔勒香梨果实上，致病率均为100%，病害症状如图4所示，白杨树、柳树腐烂病病菌引起的病害症状颜色均较深，其病斑与梨树腐烂病病菌引起的病害症状完全不同，三者的病斑大小表现为梨树腐烂病病菌>柳树腐烂病病菌>白杨树腐烂病病菌。综合分析3种病原菌在梨树枝条、叶片和果实上的致病情况，梨腐烂病病菌在梨树上的致病性最强，其次为柳树腐烂病病菌，而白杨树腐烂病病菌的致病力最弱。

为进一步研究白杨树上的腐烂病病菌侵染梨树后其致病力的变化情况，将梨树果实发病后分离获得的菌株作为2代进行接种，将再次分离得到的菌株作为3代进行接种，观察继代接种后病原菌的致病力变化情况。由图5可知，柳树腐烂病病菌的2代致病力有所下降，但3代致病力又有所上升，且高于1代的致病力。白杨树腐烂病病菌的致病力则逐代增强。因此，推测这2种病菌反复侵染梨树后，其致病力会逐渐增强。

3 讨论

腐烂病是危害果树和林木枝干的主要病害，一些来源于不同寄主的腐烂病病原菌能够侵染其他寄主植物，引起危害[11-14]。本试验通过柯赫氏法则、ITS序列和菌落形态特征确定了引起库尔勒地区香梨梨树腐烂病的病原菌为Valsamalivar.pyri，引起白杨树腐烂病的病原菌为Valsasordida和Cytosporatranslucens。本研究发现，白杨树上分离得到的2种腐烂病病菌均能够成功侵染香梨梨树枝条，这与郭众仲等的研究结果[13]一致。但是，本研究发现分离鉴定的梨树腐烂病病菌对白杨树枝条的侵染成功率仅为8.9%，且病斑扩展较小。周玉霞等研究发现，梨树腐烂病病菌不能侵染白杨树枝条[15]，本研究的结果与之相符，这表明白杨树对梨树腐烂病病菌的侵染具有较强的抵抗能力。

虽然在室内试验中白杨树上的腐烂病病菌可以侵染梨树枝条，但是其接种发病率和致病力均明显低于梨树腐烂病病菌。另外，梨树腐烂病病菌在梨树各类伤口上均表现出强大的生存竞争能力，限制了其他腐烂病病菌的定殖侵染。但继代接种试验结果表明，白杨树腐烂病病菌的致病力可以在梨树寄主上逐代变强。长期疏于对果园周边白杨树腐烂病的管理和防治，可能导致其成为梨树腐烂病的潜在侵染源。

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