黑蒜加工过程中多酚含量变化及抗氧化活性

强 倩， 罗海青， 张建梅， 沈 婷， 王新风， 胡卫成， 纪丽莲，3

(1.淮阴师范学院/江苏省高校区域现代农业与环境保护协同创新中心，江苏淮安 223300； 2.淮阴师范学院生命科学学院/

大蒜是一种古老的药食两用植物，在我国已有2 000多年的种植历史[1]，是我国的特色农产品和传统调味料，其性味温热，具有抗菌、抗氧化、降血糖、护肝及杀虫等性能[2]。此外，大蒜作为一种具有多种生物学效应的传统药物，能缓解疲劳，增加体力，帮助消化，预防腹泻及蠕虫感染，可用于治疗心脏病和关节炎[3]。相关研究表明，大蒜具有抗肿瘤功能，可诱导人体产生强烈的TH1免疫反应[4]。我国大蒜消费主要以其原料和初级加工产品为主，其中腌渍蒜产品在大蒜的加工和贸易中占主要地位[5]。目前，几种大蒜产品如脱水大蒜粉、大蒜精油、大蒜油浸膏和老化的大蒜提取物已被逐渐引入市场[6]。

黑蒜，又名黑大蒜，是以新鲜大蒜为原料，在严格控制温度和湿度的情况下发酵而成的一种新型大蒜制品。黑蒜在加工过程中，自身的组织被破坏，其物质所发生的一系列的酶促反应和非酶褐变反应，其中包括美拉德反应、焦糖化反应等[7]。黑蒜在加工过程中变成黑色，同时，呈色物质本身也有一些生物活性。加工后的黑蒜无辛辣及刺激性气味，具有高含量的多糖、还原糖、蛋白质、酚类化合物、有机硫化合物和类黑素[8]，其中多酚类物质含量高出5倍以上[9]，其超氧化物歧化酶活性高出10倍以上[10]，这使得生大蒜的抗氧化功效有了很大的提高，对保持人体健康起着积极作用。目前对黑蒜的相关文献报道很少，对黑蒜抗氧化机制的研究尚未清楚，为了对黑蒜的进一步开发利用提供科学依据，本试验对黑蒜的抗氧化性进行研究，并以DPPH清除率、Fe3+还原能力、ABTS清除率及氧自由基清除能力测定黑蒜的抗氧化能力，以期明确黑蒜的抗氧化能力，为黑蒜深加工利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白蒜及黑蒜由菏泽天鸿果蔬有限公司提供；2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、水溶性维生素E(Trolox)、荧光素(FL)、2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(ABAP)槲皮素(Quercetin)、没食子酸、福林试剂、碳酸钠、铁氰化钾、硫酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化铁、甲醇、无水乙醇均为分析纯。

DHG-9240A型烘箱，上海精宏实验设备有限公司；Centrifuge 5418型离心机，德国Eppendorf公司；分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；ecan infinite M200PRO酶标仪，瑞士Tecan公司；Q-250B3高速多功能粉碎机，上海冰都电器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品提取液的制备 将新鲜的白蒜、黑蒜烘干至恒质量，加入粉碎机粉碎后，分别称取1 g白蒜、黑蒜样品机械粉，按1 ∶20的料液比加入50%的乙醇溶液20 mL，于30 ℃超声提取30 min，离心、过滤，用50%的乙醇定容至20 mL作为样品液待用。

1.2.2 黑蒜加工前后多酚含量的测定[11]

1.2.2.1 多酚标准曲线的绘制 准确称取0.02 g没食子酸标准品置于烧杯中，用80%乙醇溶解后定容至50 mL，得到400 mg/mL没食子酸标准溶液。用移液枪吸取没食子酸的标准溶液0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、350.0、400.0 μL，分别置于12支离心管中，向每支离心管中各加入80%乙醇至0.2 mL。依次加入1 mL蒸馏水，0.2 mL 福林试剂，混匀静置3 min后，加入0.6 mL 7.5%碳酸钠，再次混匀，静置40 min后，在D765 nm处测定其吸光度。并以没食子酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，y=0.007 1x+0.016 9，r2=0.999 8。式中y为吸光度；x为多酚质量浓度(mg/mL)。

1.2.2.2 样品测定 取制备好的白蒜、黑蒜乙醇提取液 1 mL，按照标准曲线的测定方法，在D765 nm处测定其吸光度。根据回归方程计算黑蒜加工过程中多酚含量，样品总多酚含量以每克样品中所含没食子酸的毫克数表示(mg GA eq/g)。

1.2.3 黑蒜加工前后体外抗氧化能力的测定

1.2.3.1 清除DPPH自由基的测定 按浓度大小依次向96孔透明板中加入100 μL白蒜、黑蒜提取液(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg/mL)，再分别加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液。依照相同的操作方法，将不同浓度的样品液分别与甲醇混匀作为空白组，DPPH溶液与甲醇混匀作为对照组。室温避光静置30 min后，在D517 nm处测其吸光值，重复3次，每次3组平行，取平均值。

式中：D1为DPPH溶液与样品液的吸光度之和；D2为样品液与提取溶剂的吸光度之和；D3为DPPH溶液与提取溶剂的吸光度之和。

1.2.3.2 Fe3+还原能力的测定[12-13]准确吸取0.2 mL不同浓度白蒜、黑蒜提取液(0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/mL)置于5支2 mL离心管中，分别加入0.5 mL 0.2 mol/L pH值6.6磷酸缓冲液和0.5 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀后，于50 ℃温度下水浴20 min，然后加入0.5 mL 10%的三氯化铁溶液(TCA)，混合均匀，置于离心机中以 5 000 r/min 离心5 min，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL蒸馏水和0.1 mL 0.1%氯化铁溶液，混匀后，静置10 min，在D700 nm处测其吸光值，重复3次，每次3组平行，取平均值。

1.2.3.3 清除ABTS+自由基的测定 用PBS(pH值=7.4)配制7 mmol/L的ABTS+溶液，将7 mmol/L的ABTS和 2.45 mmol/L 过硫酸钾等体积混合均匀，在室温下避光反应12～16 h生成ABTS+储备液，使用前用PBS稀释到D734 nm处吸光度为0.66±0.03的工作液。取20 μL不同浓度白蒜、黑蒜提取液(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg/mL)加到96孔透明酶标板中，分别加入150 μL 0.2 mmol/L ABTS+储备液，以PBS作为对照，室温下反应 10 min 后，在D517 nm处测其吸光值，重复3次，每次3组平行，取平均值。

式中：D0为ABTS+工作液与PBS的吸光度之和；D为ABTS+工作液与样品液的吸光度之和。

1.2.3.4 氧自由基吸收能力(ORAC)的测定 取不同浓度白蒜、黑蒜提取液(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg/mL)和Trolox标准液(用pH值=7.4的75 mmol/L PBS稀释)20 μL加到96孔黑色酶标板中，分别加入180 μL FL，在37 ℃条件下孵育20 min，随后加入20 μL 119 mmol/L的ABAP溶液。用485 nm激发波长和535 nm发射波长测定其荧光强度，测定时间间隔为5 min，连续测定35次。ORAC值以Trolox当量表达，单位为mmol TE/g DW。

2 结果与分析

2.1 黑蒜加工前后多酚含量比较

多酚类物质含有多个酚基团，具有良好的抗氧化性和抗癌活性。多酚类物质种类很多、结构各异，其抗氧化性、生物利用率及对人体影响也有所不同，在食品医药中具有广泛的应用。多酚类物质的提取率不仅因溶剂种类、提取时间、提取温度、溶剂用量等条件的不同而存在差异，同时，在天然产物中多酚类物质因种类的不同，其含量也存在很大差异[14]。本试验利用50%的乙醇分别对白蒜、黑蒜粉末进行提取，采用福林-酚法测定其多酚的含量，从图1可以看出，白蒜、黑蒜的多酚含量分别为0.49、2.60 mg GA eq/g，二者差异显著。表明黑蒜在发酵过程中，多酚含量增加，本结果与连毅等的研究结果[9]一致。安东认为，多酚类物质含量的增加可能是因为大化合物释放出更多的酚羟基，使多酚的相对含量升高[15]；Kwon等指出，可能是在高温情况下其他化合物转化成了多酚类物质[16]。表明黑蒜在发酵过程中多酚类物质增加，使黑蒜具有更好的抗氧化、抗癌活性。

2.2 黑蒜加工前后体外抗氧化活性

酚类物质组成比较复杂，其种类和含量随着植物品种、成熟度、季节域等不同有很大差异，单一的抗氧化方法很难完全有效地对其含量及活性进行测定，而且不同的方法研究结果也存在很大差异，且缺乏可比性。因此，选用多种方法对其进行研究，力求全面对其抗氧化活性进行评价。

2.2.1 黑蒜加工前后对DPPH自由基的清除作用 DPPH是一种具有单电子、稳定的氮中心的自由基，广泛用于动植物提取物或者食品的抗氧化特性评价。当自由基清除剂存在时，DPPH自由基接受一个电子或氢原子，形成稳定的化合物，使其溶液从深紫色变为淡黄色，变色程度与其接受的电子数量成定量关系，可通过吸光值大小来判断清除能力。本研究用酶标仪对其吸光值进行测定。从图2可以看出，黑蒜在加工前后对DPPH自由基都有清除能力，且随着样品浓度的增加，DPPH的清除能力增强，黑蒜加工前后半抑制浓度IC50(指对DPPH自由基清除率达到50%时所需样品的浓度)分别为13.98、5.99 mg/mL，与王卫东等所报道的黑蒜的自由基的清除率是普通大蒜的3倍结论[17]一致。这可能是由于黑蒜加工过程中多酚含量增加，抗氧化能力增强，对自由基的清除能力也增强。

2.2.2 黑蒜加工前后的还原力 还原力是用来评价抗氧化剂活性的常用方法，根据样品本身的还原作用，给出电子清除

自由基，样品作为一种还原剂，其还原能力越强，抗氧化能力越强，反之越弱。相关文献报道，样品中的多酚类化合物可作为一种很强的天然抗氧化剂，具有很强的抗氧化性，可以通过测定其还原力来评价其抗氧化能力。从图3可以看出，不同质量浓度下白蒜与黑蒜提取液还原能力的强弱，相同浓度下黑蒜的还原力明显高于白蒜，在低浓度情况下白蒜和黑蒜的还原能力不明显，当浓度达到2.5 mg/mL时，黑蒜的还原力为白蒜的1.82倍，且随着提取液浓度的升高，还原能力也逐渐升高。相关文献报道样品的还原能力强弱与样品中所含的多酚类物质呈正相关性[18]，本试验中，白蒜总酚的含量 0.49 mg GA eq/g，而黑蒜的总酚含量达到 2.60 mg GA eq/g，是白蒜的5倍之多，从而证实了黑蒜的还原能力强于白蒜。

2.2.3 黑蒜加工前后对ABTS+自由基的清除 从图4可以看出，黑蒜加工前后ABTS+清除能力与浓度呈正相关性，即随着样品浓度的增加，清除率逐渐升高，黑蒜ABTS+清除率明显高于白蒜，且随着样品浓度的增大清除能力差别明显。在浓度为0.05 mg/mL时，白蒜、黑蒜提取液对ABTS+没有清除作用，随着浓度的增大，当浓度为0.50 mg/mL时，白蒜的清除率为6.23%，黑蒜的清除率为20.35%；当浓度为 1 mg/mL 时，白蒜的清除率为11.23%，黑蒜的清除率为38.71%，即随着浓度的增加，白蒜、黑蒜的清除率都在上升，且黑蒜的清除能力强于白蒜。这可能是由于浓度的增大，白蒜、黑蒜中活性成分含量升高。总体来看，黑蒜提取液的ABTS+自由基的清除能力明显优于白蒜，一方面可能与多酚含量有关，黑蒜在加工过程中多酚含量是白蒜的5倍以上；另一方面可能与多酚的形态有关，黑蒜在加工过程中可能产生很多游离多酚类物质且其具有很强的ABTS+自由基清除能力。因此，黑蒜对ABTS+的清除率明显高于白蒜。

2.2.4 黑蒜加工前后对氧自由基的清除能力 ORAC抗氧化原理是指自由基能破坏荧光探针，使荧光强度发生变化，其变化的大小反映自由基破坏的程度。抗氧化剂可以抑制由自由基引起的荧光变化，而抑制程度能反映其对自由基的抗氧化能力的大小。从图5可以看出，无论是白蒜、黑蒜均显示出对氧自由基清除能力，但是黑蒜的清除能力比白蒜的要强，白蒜的氧自由基吸收能力为324.43 μmol TE/g DM，黑蒜吸收能力达到了984.56 μmol TE/g DM，二者差异显著。这与DPPH、Fe3+还原能力的结果一致，这是由于黑蒜中的多酚含量明显高于白蒜。

3 结论

与普通的白蒜相比，黑蒜以其极高的营养价值和保健价值受到很多消费者欢迎。黑蒜加工前后的多酚含量存在显著差异，经发酵后的黑蒜多酚含量增加了4倍以上，使黑蒜具有更好的抗氧化、抗癌活性。黑蒜加工过程中多酚含量增加，抗氧化能力增强，使得加工后的黑蒜对DPPH自由基清除能力增加了1倍多。黑蒜加工前后的还原能力与其多酚含量呈正相关，相同浓度下，经发酵后的黑蒜的还原力明显高于白蒜；ABTS+清除能力与浓度呈正相关，黑蒜ABTS+清除率明显高于白蒜，且随着样品浓度的增大清除能力差别明显。黑蒜加工前后都具有对氧自由基清除能力，但加工后的黑蒜的清除能力显著高于白蒜。黑蒜在加工过程中多酚含量增加，加工后的黑蒜对DPPH的清除率、还原能力、ABTS+自由基清除率及对氧自由基的清除能力都显著高于白蒜，表明黑蒜抗氧化能力远远高于加工前普通白蒜。本研究结果为黑蒜研究及发展提供了理论依据，并为大蒜市场发展提供了广阔前景。

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