定向诱导间充质干细胞成软骨分化相关活性因子研究进展

陈锦富 耿倚云 王大平

【提要】 关节软骨受损或缺失，是导致关节炎等渐进性疾病的主要原因，严重影响患者生活质量。成熟的透明软骨由于缺乏神经支配和血管供应，且软骨细胞增殖能力差，所以很难自我修复。自体软骨细胞移植尚存在局限性，且操作复杂，阻碍了临床应用。间充质干细胞增殖能力较强，并保留有分化潜力，但向成软骨分化需要一定的条件，如细胞因子、支架材料、培养基等。寻找促进诱导间充质干细胞成软骨分化的活性因子，是目前关节软骨再生的重要研究方向。本文就诱导间充质干细胞向软骨分化的相关活性因子的研究进展进行综述。

关节软骨缺乏血管和神经，损伤后较难修复，传统的微骨折术、软骨移植术等治疗效果并不理想。所以，组织工程技术再生关节软骨成为研究焦点。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）能够多向分化，且来源广泛、取材方便、损伤小、免疫原性低、增殖迅速、表型稳定，能够在体外定向分化并用于软骨修复。在诱导间充质干细胞向软骨分化的过程中，细胞因子具有重要的调控作用，但该作用的具体机制尚不清楚。已有研究显示，细胞因子能使MSCs处于一种前软骨浓缩的状态，促进细胞的增殖，并向软骨细胞分化，这与胚胎时期的枝芽形成相似。在这种状态中，MSCs将表达Sox9，这是软骨形成的关键调节因素[1]。目前，寻找有效的方法来生成成熟的透明软骨依赖于识别和操纵信号传导通路，从而促进干细胞向软骨分化和软骨形成[2]。本文将针对诱导MSCs成软骨分化的细胞因子和其他活性因子研究进展进行综述。

1 经典细胞因子

1.1 转化生长因子-β（TGF-β）

TGF-β是一组能调节细胞生长和分化的超家族因子。除了 TGF-β 之外，还包括活化素（Activins）、抑制素（Inhibins）和骨形成蛋白（BMPs），在软骨形成的所有阶段都非常重要。但是，也有研究认为TGF-β不需要全程添加[3]。通过研究水凝胶中的MSCs与TGF-β的接触时间发现，TGF-β主要作用于诱导干细胞分化的前、中期。目前认为，TGF-β除了具有促进软骨细胞增殖和维持软骨细胞肥大化的作用外，还在关节软骨的维护和修复中具有重要作用[4]，且TGFs在防止软骨细胞去分化和促进细胞生长方面是有效的[5]，TGF-β通路已被证明在成骨和成软骨分化体系中具有重要作用[6]。Roelen等[7]发现并进一步证实了TGF-β信号传导在Smad3通路中具有重要作用，因为TGF-β通过Smad3通路可以抑制MSCs向脂肪分化，阻断了Smad 3介导的TGF-β信号传导致成脂分化。TGF-β也可以激活MAPKs（丝裂原活化蛋白激酶）路径，MAPKs包括JNK、p38和ERK，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与大量的细胞活动，如增殖、炎症、迁移和分化[8]，JNK、p38和ERK能够通过不同的信号通路调节TGF-β，刺激间充质干细胞向软骨分化及软骨形成[9-10]，当TGF-β1过表达时，ERK、JNK和c-Jun的磷酸化水平会升高，而TGF-β1沉默时会明显下降，这提示TGF-β1可以激活ERK/JNK的信号通路。最近的研究表明，维生素D可以促进Sox9、Col-Ⅱ、聚集蛋白聚糖和Col-Ⅹ的表达，从而诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化，TGF-β1通过激活ERK/JNK通路，提高了维生素D诱导骨髓间充质干细胞增殖、迁移和成软骨分化的作用[11]。该发现对于MSCs治疗由软骨损伤导致的骨关节炎具有重要的应用价值。关于维生素D和TGF-β1之间相互作用的更多细节，以及这两种信号传导途径的改变对于干细胞分化及治疗的作用，还有待于进一步的研究证实。

1.2 骨形态蛋白（BMPs）

BMPs有20个成员，是TGF-β超家族的一员，是软骨合成代谢、软骨细胞再生中的主要活性因子之一，也能够诱导间质干细胞成软骨分化和软骨骨化。其中 ，BMP2、4、6和7与诱导MSCs成软骨分化有密切联系，已经被证明可以促进胶原蛋白和其他软骨细胞外基质蛋白的生成[12]。但是在软骨形成的过程中，BMP7和BMP2、3、4和5都在软骨膜中表达，只有BMP7在增生的软骨细胞和成熟软骨中表达[13]。研究表明，与其他骨形态蛋白相比，BMP7可能是一种更强大的生长因子。BMP7可作为一种强有力的合成代谢性因子，通过刺激体内成熟的软骨细胞发挥抗凋亡作用，以促进细胞的存活[14]。多项研究显示，BMP7可以促进间充质干细胞向脂肪、骨组织和软骨分化[15-17]。BMP2已用于骨不连的临床治疗，并且具有极大的潜力可诱导软骨形成，并可用于软骨再生，修复软骨缺损。BMP2已经被证明能诱导各种类型的干细胞分化，如hMSCs[18]、ADSCs[19]和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）[20]等。 此外，BMP2已被证明比其他细胞因子，如 BMP4、BMP6、BMP7、TGF-β和IGF-1，更能诱导间充质干细胞成骨分化和成软骨分化。有研究表明，BMP2可在体外的培养体系中自行诱发成软骨分化、成骨分化。此外，BMP2在软骨形成过程中可促进Sox9表达。因此，BMP2可被用于软骨组织工程以调节软骨的形成，但是为了保持软骨的表型，必须对软骨组织工程进行适当的调控[21]，例如低氧/HIF-1α对Sox9和Runx2的表达进行了调节，增强了BMP2诱导的成软骨分化，抑制成骨分化和软骨内骨化，并维持软骨表型[22]。然而，在软骨修复过程中软骨表型的维持仍需要进一步的研究。

1.3 胰岛素样生长因子（IGF）

IGF能够通过刺激细胞增殖、调节细胞凋亡和诱导软骨细胞相关标志基因的表达来促进软骨形成。IGF-I被认为是软骨形成的重要生长因子之一[23]。据报道，IGF-I可以招募关节内软骨细胞修复关节软骨损伤[24]。研究表明，IGF-I能增强软骨细胞的代谢，可以调节间充质干细胞向软骨分化，同时保持间充质干细胞向软骨分化的潜能[25]。但是，也有研究认为IGF-I对MSCs成软骨分化的诱导没有显著的作用[26-27]。

1.4 成纤维细胞生长因子（FGFs）

FGFs是信号蛋白家族中的一员，FGFs及其受体（FGFRs）在MSCs向软骨分化及软骨形成过程中有重要作用，FGFs能促进软骨细胞增殖并抑制其肥大化[28]。FGF信号分子及其细胞表面酪氨酸激酶受体与四肢发育早期阶段的骨骼形成密切相关；抑制FGF信号会导致软骨发育不良[29-30]。MSCs在体外培养时，FGF是促进其增殖及维持其分化潜能的主要细胞因子。FGF信号通路不仅与骨骼系统的发育有关，还与软骨形成密切相关，有研究利用FGF9和FGF18基因敲除小鼠证明了FGFs是Runt相关的转录因子2（RUNX2）的上游细胞因子，并能促进未成熟的软骨细胞增殖和成软骨分化[31]。FGF在诱导MSCs成软骨分化时，能够提高软骨微球中的蛋白多糖的生成。研究表明，FGF信号对胚胎软骨发育具有非常重要的作用，FGF9基因突变的小鼠容易出现关节连接处软骨畸形发育[32]。FGF已经被证明了能够上调转录因子Sox2并抑制Wnt信号从而导致MSCs成骨分化能力下降。FGF在抑制Wnt信号的同时，还可以在早期阶段促进MSCs向软骨分化[33]。最近有研究通过分阶段添加FGF诱导MSCs成软骨分化，提示了在诱导分化的过程中，除了需要考虑不同细胞因子的生物作用外，还应该考虑添加诱导剂的时间，以利于更好调控成软骨诱导分化[2]。

2 联合应用

MSCs成软骨分化需要多种细胞因子的调控，许多研究发现联合使用不同的细胞因子比单独使用一种细胞因子具有更优的促分化作用。TGF-β除了自身具有较强的诱导间充质干细胞向软骨分化的作用外，还可以与其他细胞因子共同发挥作用。此外，TGF-β常应用于生物支架材料上，可以显著地诱导间充质干细胞成软骨分化。诱导MSCs成软骨分化的研究中，BMPs经常与TGF-β1或TGF-β3组合，通过这些生长因子的组合，增强细胞内成软骨相关信号通路和下游SOX9的激活，从而促进软骨形成。研究表明，当TGF-β1单独用于软骨生成时，胚胎干细胞（ESC-MSC）与骨髓干细胞（BMSCs）相比，产生的与软骨形成相关的细胞外基质较少。然而，通过补充BMP7到含有TGF-β1的培养基中，ESC-MSC可以产生大量的软骨外基质[16]。与单独使用TGF-β1相比，TGF-β1和BMP7的结合可能会促进ESC-MSC生成TGF-β1和TGF-β1受体，从而增强ESC-MSC向软骨分化。此外，Lee等[34]的研究结果表明，当TGF-β1和BMP7一起诱导ESC-MSC成软骨分化时，SMAD3和SMAD 1/5介导的信号通路都被激活，而单独使用TGF-β1作为诱导剂时只能激活SMAD3。虽然TGF-β和BMPs可以协同作用于ESC-MSC，但其具体调控机制尚未确定。还有研究认为，IGF与TGF-β有协同作用，IGF-I可以通过提高TGF-β的代谢活性和抑制其细胞毒性来增强软骨细胞和MSCs的成软骨分化[35]。与单独使用IGF诱导间充质干细胞成软骨分化相比，增加了TGF-β因子的辅助后，胶原蛋白Ⅱ、聚蛋白多糖和Sox9的表达会明显上升，有利于软骨形成[36]。Du等[37]研发了一种FGF和TGF-β双释放水凝胶系统，证明了这种组合能够增强MSCs成软骨分化的能力。MSCs成软骨分化是一个复杂的过程，需要多种因素的调控。目前，关于细胞因子调控作用的研究较为深入，但是其具体的调控机制尚未明确，联合使用不同的细胞因子调控间充质干细胞成软骨分化是当前研究的重要方向。

3 新型诱导因子

Kartogenin（KGN）是一种新型的小分子化合物，最初由Johnson等[38]在2012年发现，他们从22 000多种不同结构的杂环类药物性化学分子中挑选出这种复合物，具有强大的促软骨分化能力，能促进骨髓间充质干细胞定向成软骨分化。KGN还具有良好的生物相容性及软骨保护作用[39]。Lubricin是由软骨细胞分泌到软骨表面的一种黏液糖蛋白，具有保护软骨的作用。Liu等[40]的体外研究发现，KGN与TGF-β1、BMP-7联合使用能促进Lubricin生成。KGN与BMSCs及软骨细胞共同培养，能够提高Lubricin、胶原蛋白Ⅱ、葡糖氨基葡聚糖等合成，促进软骨形成[41]。Shi等[42]发现，KGN在体外能促进滑膜间充质干细胞软骨分化。目前，KGN促进成软骨分化的具体机制尚未明确。

miRNAs是一种内源性非编码小分子RNA，参与了细胞的多种生物活动，包括细胞的增殖、分化、凋亡等。Tian等[43]将miRNA-30a转染至BMSCs后发现，Ⅱ型胶原蛋白和聚蛋白多糖等软骨基质表达有所提高，能够明显促进BMSCs成软骨分化。当抑制miRNA-30a后，促进分化的过程也被抑制。当miRNA-30a过度表达时，Delta-like 4（DLL4）在转录和翻译的水平上表达下降，这也有利于促进MSC的成软骨分化。Zhang等[44]发现，miRNA-410能够结合Wnt3a基因位点，从而下调Wnt通路，促进BMSCs成软骨分化，提示miRNA-410可能与干细胞的成软骨分化有关。

Mg合金具有抗炎作用，能够减少炎性因子的分泌，间接地促进间充质干细胞向软骨细胞分化[45]。此外，Mg和Mg-Sr合金对兔BMSCs无细胞毒性，而且有促进增殖和成软骨分化的作用，两者的作用无明显差别[46]。

4 总结与展望

MSCs向软骨分化的潜能在软骨再生的研究中具有无可替代的作用与广阔的应用前景。提高诱导的效率与质量仍是研究的重点和亟待解决的问题。TGF-β、BMPs、IGF及FGF是目前研究较多、诱导作用较明确的生长因子。但是，MSCs向软骨定向分化是需要多种因素共同调控的。所以，各种生长因子之间的相互作用，生长因子与培养体系的相互影响都需要进行更为深入的研究，以期获得最适的组合，甚至研发出用于体内的缓释体系，为临床治疗提供新方法，避免手术及关节腔内注射带来的痛苦和并发症。近年来，Kartogenin（KGN）、miRNAs等新型诱导因子已经应用在 MSCs成软骨分化的研究当中，这给我们的研究提供了更多的方向，未来的深入研究也许能为软骨损伤提供一种新的治疗方式。