甘草酸对UVB诱导人皮肤角质形成细胞凋亡的影响

傅 云，廖 建，张 琼，王冬梅，王业秋，李建民，张丽宏

（1.黑龙江中医药大学 黑龙江 哈尔滨 150040；2.四川省中西医结合医院 四川 成都 610041；3.内江市中医医院 四川 内江 641000）

近年来，随着工业化生产的快速发展，环境污染日益加重，臭氧层阻挡紫外线（ultraviolet, UV）的能力减弱，辐射至地球表面的UV逐渐增多[1]。中波紫外线（UVB）波长为290～320nm，长时间接受过度的UVB辐射将导致皮肤光损伤，引发一系列形态学、组织学及生理学转化[2-3]，导致皮肤皱缩、无弹性、无光泽，严重可致色素沉着及恶性肿瘤发生[4]。长期的UVB辐射引起的炎症反应、氧化应激、DNA损伤和细胞凋亡等是直接导致皮肤光老化的重要机制[5]，同时UVB辐射导致大量活性氧自由基（ROS）堆积于体内，可诱导凋亡相关蛋白的表达，加速细胞凋亡的发生[6]。UVB主要影响人体皮肤表皮细胞，表皮细胞大部分由角质形成细胞（human keratinocytes, HaCaT）组成[7]。研究表明[8]，当UVB照射剂量为30mJ/cm2时，即可导致人皮肤HaCaT细胞光损伤，并且发生凋亡和坏死。甘草酸是甘草根部提取物中含量较高的重要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗过敏、调节免疫、抑制黑色素沉着、抗癌等功效[9]。此外，甘草酸还具有一定的光热稳定性，可减轻紫外线辐射造成的皮肤光损伤[10]。目前，对于甘草酸通过自身抗氧化、抗炎等药理作用保护皮肤光老化的研究较多，而对于甘草酸能否抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡及其相关机制尚不明确。因此，本实验应用总剂量为30mJ/cm2的UVB诱导HaCaT细胞凋亡，用不同浓度的甘草酸作用于HaCaT细胞，探讨甘草酸对UVB诱导HaCaT细胞凋亡的影响及相关机制。

1 材料

1.1 细胞株：人皮肤角质形成细胞（HaCaT）（上海中乔新舟有限公司，批号ZQ0044）。

1.2 药物和试剂：甘草酸标准品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-16081812）；Annexin-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20170524）；AMV第一链cDNA合成试剂盒（生工生物工程有限公司，批号B532445）；SGExcel UltraSYBR Mixture(With ROX)（生工生物工程有限公司，B532956）；羊抗兔二抗（博士德生物有限公司，批号BA1054）；兔抗人β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体，兔抗人Caspase-3、Caspase-9多克隆抗体（博奥森生物有限公司，批号分别为bs-0081R，bs-0049R）。

1.3 仪器：HF240型CO2培养箱（上海力申科学仪器有限公司）；MK3型酶标仪（上海热电仪器有限公司）；HPC-150型流式细胞仪（Handyem公司）；GTR16-2型高速台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；mini PROTEAN Tetra Cell型电泳仪，Trans-Blot SD Cell型半干转膜仪（英国Bio-Rad公司）；Smart chemi Ⅱ型一体式微型化学发光成像仪（北京赛智创业有限公司）；Nano-100型微量分光光度计（杭州奥胜仪器有限公司）；Mx3 000P型实时定量PCR扩增仪（安捷伦科技有限公司）。

2 方法

2.1 甘草酸有效安全浓度的筛选：取对数生长期的人皮肤角质形成细胞（HaCaT），胰酶消化，离心，计数，以浓度为1×104个/孔的细胞数接种至96孔板，每组6个复孔，96孔板的四周用PBS封闭，于37℃、5%CO2的培养箱中培养24h。96孔板内细胞随机分为空白组和甘草酸组。吸弃培养液，空白组加入200μl新培养液；甘草酸组分别加入（1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9，1×10-10）mol/L甘草酸，200 µl/孔。培养24h后，加入5g/L MTT，20μl/孔，孵育4h，吸弃培养液，加入二甲基亚砜（DMSO），150μl/孔，于37℃恒温培养震荡器上震荡10min，在酶标仪492nm波长处测定吸光值（OD）。

2.2 MTT法测定HaCaT增殖率：96孔板内细胞随机分为空白组、UVB组、甘草酸+UVB组。细胞培养24h后，吸弃培养液，PBS清洗2次，每孔加200μl PBS，使用铝箔纸将空白组覆盖，用30mJ/cm2UVB照射UVB组和甘草酸+UVB组，根据公式：照射剂量（mJ/cm2)=照射强度（mW/cm2)×照射时间(s)，辐射强度为0.5mW/cm2，计算出照射时间为60s。照射完毕，弃去PBS，甘草酸+UVB组分别加入1×10-7，1×10-6，1×10-5mol/L甘草酸，200μl/孔，UVB组和空白组加入DMEM培养液，200μl/孔，培养24h，加入MTT，20μl/孔，孵育4h，吸弃培养液，加入DMSO，150μl/孔，37℃恒温培养震荡器上震荡10min，在酶标仪492nm波长处测定吸光值（OD）。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率：取对数生长期的HaCaT细胞，胰酶消化，离心，计数，以浓度为1×106个/孔的细胞数接种至6孔板。6孔板内细胞参照2.2方式进行分组和造模。待细胞生长密度达80%～90%时，收集6孔板中各组细胞，将旧培养液吸取至15ml离心管中，使用PBS清洗细胞2次，加入胰蛋白酶进行消化，再加入旧培养液终止消化，1 000rpm，离心5min，弃上清，加入3ml PBS重悬，在细胞计数板上计数，取4～12万个细胞，置于1.5ml离心管中，1 000rpm，离心5min，弃上清。按照试剂盒说明书操作，最后用流式细胞仪检测，检测结果用Flowjo软件处理。

2.4 实时荧光定量（RT-PCR）法检测Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达水平：待细胞生长密度达80%～90%时，收集6孔板中各组细胞，每管细胞中加入1ml细胞裂解液（Trizol），室温下静止10min，用移液枪吹打5min，使细胞完全破碎，转移到1.5ml EP管中。每个EP管对应加入0.2ml氯仿，剧烈晃动15s，室温静置3min，4℃，13 200rpm，离心15min。将上层液体提取约400μl至EP管中，每管加入等体积的异丙醇，上下颠倒使混匀，-20℃过夜。-20℃取出后，4℃，12 000rpm离心10min，EP管底部有少许的白色物质，即为总RNA，弃上清，加入预冷的75%乙醇，移液枪吹打洗涤RNA，4℃，10 500rpm离心5min，倒扣控干液体10min，加入20μl无RNA酶水溶解RNA。用Nano-100微量分光光度计测总RNA的浓度及纯度，取A260/A280吸光度比值在1.8～2.0之间得样品用于后续实验。根据cDNA逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。20μl体系[MLtraSYBR Mixture(2×) 10μl，正向和反向引物各0.4μl，ddH2O 8.4μl，cDNA 0.8μl]进行反应，反应条件：95℃ 3min（预变性），95℃ 20s（变性），72℃ 20s（退火/延伸），40个循环。在扩增程序中读取不同组的Ct值，按照2-△△Ct分析法，公式为：∆∆Ct=（Ct目的基因-Ct内参基因）给药组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照组，计算出各组mRNA的相对表达。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列信息

2.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平：待细胞生长密度达80%～90%时，收集6孔板中各组细胞，裂解液（RIPA）和蛋白酶抑制剂（PMSF）以99:1的比例混匀，以100μl/孔的量加入混合液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白样品和上样缓冲液以4:1的比例混匀，加热煮沸10min。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）80V，30min，更换电压110V，60min。半干转膜30min，室温封闭2h，用封闭液以1:500的比例稀释一抗，4℃过夜，TBST洗膜4次，加二抗（1:10 000稀释），置于水平摇床上孵育2h，TBST洗膜4次，加入ECL发光液（A液和B液按1:1的比例配制），使用发光成像仪拍摄，利用Lane ID凝胶软件分析各条带的灰度值，以目的条带灰度值和内参条带灰度值的比值，反映目的蛋白表达水平。

2.6 统计学分析：采用SPSS 21.0软件进行分析，实验数据以x¯±s表示，组间比较采用ANOVA方差分析，多组间比较采用LSD、SNK法检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 甘草酸对正常HaCaT细胞增殖率的影响：与空白组比较，1×10-8、1×10-9、1×10-10mol/L甘草酸可明显促进细胞增殖（P＜0.01）；1×10-3、1×10-4mol/L甘草酸可明显抑制细胞增殖（P＜0.01）；1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸组细胞增殖率与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），对细胞无明显的促进及抑制作用。因此，本实验选择10-7、10-6、10-5mol/L甘草酸用于后续实验研究。见表2。

表2 甘草酸对正常HaCaT细胞增殖率的影响 （x¯±s，n=6）

3.2 甘草酸对光老化HaCaT细胞增殖率的影响：与空白组比较，UVB组细胞增殖率显著降低（P＜0.01）；与UVB组比较，1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸+UVB组细胞增殖率显著升高（P＜0.01）。见表3。

表3 甘草酸对光老化HaCaT细胞增殖率的影响 （x¯±s，n=6）

3.3 甘草酸对光老化HaCaT细胞总凋亡率的影响：与空白组比较，UVB组细胞总凋亡率显著升高（P＜0.01）；与UVB组比较，1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸+UVB组细胞总凋亡率显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表4。

表4 甘草酸对光老化HaCaT细胞总凋亡率的影响 （x¯±s，n=6）

3.4 甘草酸对光老化HaCaT细胞Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达水平的影响：与空白组比较，UVB组Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；与UVB组比较，1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸+UVB组Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表5、图1。

表5 甘草酸对光老化HaCaT细胞Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达水平的影响

图1 甘草酸对光老化HaCaT细胞Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达水平的影响

3.5 甘草酸对光老化HaCaT细胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平的影响：与空白组比较，UVB组Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与UVB组比较，1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸+UVB组Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表6、图2。

表6 甘草酸对光老化HaCaT细胞Caspase-3、Caspase-9 蛋白表达水平的影响

图2 甘草酸对光老化HaCaT细胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平的影响

4 讨论

生物体内环境的稳定，不仅需要依赖细胞的增殖、分化，细胞的凋亡也起着关键作用[11]。正常的细胞凋亡是一个主动发起以便更好维持内环境稳定的过程[12]。UVB辐射至人体皮肤，因其穿透力较浅，因此主要作用于表皮内的色基，可使组织受到损伤，导致明显的人皮肤角质细胞（晒伤细胞）凋亡[13]。细胞凋亡又称为细胞程序性死亡，可分为凋亡激活信号、启动、承诺、执行和清除五个步骤[14]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族对细胞凋亡起着关键作用，正常情况下Caspase是以无活性的酶原形式存在，在受到外界刺激时，发生水解被激活，引发Caspase级联反应[15]。目前研究认为细胞凋亡主要由两条信号通路介导，即Fas/FasL及TNF/TNFR通路和线粒体通路，而这两条通路的激活最后都需要活化Caspase完成凋亡并在Caspase-3处汇合[16]。Caspase-3被称为细胞凋亡的“执行者”，处于级联反应的中下游，是凋亡执行因子以及凋亡途径的汇聚点[17]。UVB作为凋亡刺激因素作用于细胞后，诱使活性氧（ROS）的产生，通过MAPK等信号通路可向下刺激Caspase-3，活化后的Caspase-3作用于细胞核内的DNA，在PARP-1等效应蛋白的协同作用下，使染色体固缩，并伴随着DNA片段化及凋亡小体形成等，引发细胞调亡[18]。Caspase-9 则被称之为细胞凋亡的“发起者”，活化的Caspase-9可激活Caspase-3，活化的Caspase-3可特异性的水解细胞内各种底物，从而引发 Caspase级联反应，使细胞形成典型的凋亡小体，进而导致细胞凋亡[19]。线粒体受到外界凋亡信号刺激后，促使细胞色素C由线粒体释放到细胞质中，Caspase-9可与细胞色素C以及Apaf-1结合形成活性复合体，进一步启动细胞凋亡级联反应，激活下游的效应组成员 Caspase-3、Caspase-6等，最终激活线粒体介导的细胞凋亡[20]。本实验结果显示，UVB辐射后，细胞总凋亡率显著升高，Caspase-3、Caspase-9 mRNA及蛋白表达水平均显著升高，提示UVB辐射可激活 Caspase 级联反应，可促进凋亡因子Caspase-3 及Caspase-9的表达。加入甘草酸药物干预后，细胞总凋亡率显著降低，Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白表达水平显著降低，提示甘草酸可降低Caspase-3、Caspase-9的表达水平，进一步抑制UVB诱导的细胞凋亡。

综上所述，甘草酸可通过降低细胞的总凋亡率，减少Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白的表达，从而抑制UVB辐射诱导细胞凋亡。对于甘草酸能否通过调控其他凋亡相关通路或凋亡因子的表达抑制细胞凋亡，有待进一步研究。

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