显微光学切片断层成像技术在卒中研究中的应用

潘超，张萍，唐洲平

近几年来，美国、欧洲、日本和中国相继宣布了媲美“人类基因组计划”的“脑科学计划”。这项宏伟的工程将对大脑内近千亿的神经元和血管、神经环路及其相互连接进行全面的研究。脑内的神经环路连接和血管连接是实现脑功能的基本单元。因此，如何获取高分辨的脑连接图谱是进行脑科学研究的重中之重。

2010年华中科技大学光电实验室骆清铭团队采用其自主设计研发的具有显微光学切片断层成像系统（micro-optical sectioning tomography，MOST）和发明的小鼠全脑高尔基染色、树脂包埋法，以“边切片边成像”的工作方式采集了小鼠脑高分辨高尔基结构三维数据集，是目前世界上最大的也是分辨率最高（0.33μm×0.33μm×1 μm）的鼠脑神经突起网络数据集[1]。随后，陆续又利用全脑尼氏染色、印度墨水灌注等方法采集了小鼠神经元、脑血管三维数据集[2-3]。新一代荧光MOST（fluorescence micro-optical sectioning tomography，fMOST）的开发，借助荧光标记的转基因小鼠全脑树脂包埋技术，fMOST系统在国际上首次成功获取了荧光小鼠全脑范围内长程投射神经元结构分布数据集，结合开发的神经元追踪分析技术实现了对脑内特定神经投射路径的立体观察和精确定量分析[4]（图1）。此外，整体荧光染色技术已问世，有望通过特异性免疫荧光抗体标记血管，在一份脑图谱中同时显示特定神经细胞、神经投射及血管连接网络[5]。

卒中是一类高发病率、高致死致残率的中枢神经系统疾病。目前对卒中的发病机制、发病后的病理生理变化及神经血管保护仍不甚明朗。如临床上常见到相同类型的卒中患者，梗死部位和梗死大小均相同，而临床预后可能完全不同，这很可能与患者侧支循环尤其是微循环的代偿能力不同有关。对于缺血性卒中，血管狭窄或闭塞后其脑内微循环是如何代偿的、缺血区域神经网络的供血关系是怎样变化的、出血性卒中后血肿占位及高颅内压状态下的颅内微循环是如何改变、卒中后自体血管再生的过程其发生发展机制及时空分布等，卒中后神经投射通路是否重建、与卒中后患者康复密切相关的神经重塑、血管代偿等，也是卒中患者重要的治疗靶点，目前研究亦处于较初级阶段（图2）。这些均是卒中研究的重点和难点，非常值得进一步研究。

图1 通过显微光学切片断层成像系统技术构建脑神经血管网络

图2 通过显微光学切片断层成像系统技术对卒中进行研究

磁共振血管造影（magnetic resonance angiography，MRA）、电子计算机断层扫描血管成像（computed tomography angiography，CTA）或数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）等血管成像技术能很好地观察大血管，但对微血管尤其是毛细血管难以做到精确的标记和观察。传统的血管三维可视化技术手段如微计算机断层扫描技术（micro-computed tomography，micro-CT）血管成像、同步辐射线显微断层血管成像等或成像分辨率低，或仅能显示血管网络，但丢失了神经元信息，难以同步研究神经网络与血管网络[6-7]。而对于微循环的研究，MOST系统可提供高分辨的三维可视化图谱，结合fMOST和免疫标记技术理论上能同时实现血管和神经细胞的共标记及共成像，未来借助MOST技术获得卒中疾病图谱将为进行卒中研究提供技术支持。

脑图谱的绘制已在美国、欧洲、中国等国家相继展开。目前的基本路线是从鼠类到非人灵长类再到人类，从正常脑图谱到包括脑血管疾病、脑遗传变性病等脑疾病图谱，为研究脑疾病和开发脑功能、发展人工智能等提供强有力的技术支持。虽然鼠脑疾病图谱的绘制研究正方兴未艾，但由于物种特征相差较大，鼠脑内的神经网络连接、血管分布及代偿特点与人类相差较大，不能深刻揭示人脑疾病后机制。为此，采用非人灵长类动物模拟人类疾病研究具有不可替代的作用。猴类动物的脑区分布及神经网络连接特点与人类更接近，其脑循环特点与人类相似，对研究脑缺血后的循环代偿、卒中后的血管修复、卒中后神经网络连接的变化具有天然的优势。然而，采用非人灵长类动物代替鼠类研究主要具有以下难点：①鼠脑容量远小于猴类，获取猴类脑切片并绘制超微神经血管网络的系统研制难度更大，其数据量将远大于鼠脑。目前单个小鼠全脑数据集的大小已达到10 TB级别，而绘制的非人灵长类全脑数据集的数据量将到上百TB，甚至PB级别，因此处理非人灵长类动物的脑图谱必然考验大数据的计算和存储能力，以及软件技术的开发都提出了巨大挑战[8]。②目前，单个鼠脑的样本经MOST获取0.5 μm3精度的全脑数据集24 h不间断切片成像需耗时3～10 d，若获取猴类脑数据将耗费更长时间，可达数月之久，高强度的工作对仪器的寿命和保养提出了严苛的要求，亟待解决。③较大体积的脑样本对样品制备、染色标记技术要求更高。现已有文献报道采用改进的免疫荧光标记技术对一定厚度的生物样本成功标记并获取三维图谱[5]，但尚未有研究解决如此大体积的脑标本标记难题，同时大量的抗体需求也增加了研究成本。

然而，MOST系统目前还是离体研究，不能在体观察，现阶段尚不能满足连续动态观察的需求。由于最后重建的三维图谱是基于阳性染色标记的结构与周围结构的分辨率对比，而当血脑屏障出现较大破坏时，如脑梗死后，坏死组织及水肿液等在染色过程中可能会被非特异性染色，造成背景干扰，这些对获取三维结构造成了较大视觉影响，需待开发更完善的软件系统进行辨识和分离。

1 Li A，Gong H，Zhang B，et al.Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain[J].Science，2010，330：1404-1408.

2 Wu J，He Y，Yang Z，et al.3D Brain CV：simultaneous visualization and analysis of cells and capillaries in a whole mouse brain with one-micron voxel resolution[J].Neuroimage，2014，87：199-208.

3 Xue S，Gong H，Jiang T，et al.Indian-ink perfusion based method for reconstructing continuous vascular networks in whole mouse brain[J].PLoS One，2014，9：e88067.

4 Gong H，Zeng S，Yan C，et al.Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution[J].Neuroimage，2013，74：87-98.

5 Renier N，Wu Z，Simon DJ，et al.iDISCO：a simple，rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging[J].Cell，2014，159：896-910.

6 Urao N，Okonkwo UA，Fang MM，et al.MicroCT angiography detects vascular formation and regression in skin wound healing[J].Microvasc Res，2016，106：57-66.

7 Plouraboue F，Cloetens P，Fonta C，et al.X-ray highresolution vascular network imaging[J].J Microsc，2004，215：139-148.

8 杜久林，毕国强，骆清铭，等.脑科学研究新技术[J].中国科学院院刊，2016，31：783-792.