丝裂霉素C在难治性青光眼手术中抗瘢痕作用的实验研究

难治性青光眼是指虽经最大耐受药物或激光治疗仍未能控制高眼压且由于眼局部解剖因素不适合作滤过手术或经常规滤过性手术联合抗代谢药物仍难以将眼压控制于正常范围的青光眼[1]。目前临床上常用的治疗方式之一为Ahmed 引流阀植入术，成功率为74%～91%[2]。此手术失败的主要原因是成纤维细胞的过度增殖和细胞外间质的合成使组织纤维瘢痕化，导致引流盘周围纤维化包裹继发性高眼压。为抑制成纤维细胞的增殖，阻碍瘢痕形成，提高手术成功率，临床上常于术中使用丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)等抗代谢药物。Ahmed引流阀由引流盘及硅胶引流管组成，材质均为硅胶；由于Ahmed引流阀成本较高，不适用于放入兔眼模型中进行实验，因其材质与视网膜脱离巩膜外垫压术中使用的硅胶垫材质相同，故使用硅胶垫代替Ahmed青光眼引流阀来间接验证MMC在Ahmed引流阀植入术治疗难治性青光眼中的抗瘢痕作用。该研究通过HE染色、Masson染色观察组织形态及纤维化程度，免疫组化测定转化生长因子β1(transforming growth factor beta,TGFβ1)及α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle action,αSMA)的表达情况以评估组织的纤维化程度，以判断MMC在硅胶垫植入术中的抗瘢痕作用，以间接判断其在Ahmed引流阀植入术治疗青光眼术后的抗瘢痕作用。

资料与方法

一、一般资料

健康成年獭兔21只(42只眼),体重2.0～2.5 kg，雌雄不限，无眼部疾病，安徽医科大学动物实验中心提供；硅胶垫(9 mm)；MMC(日本协和发酵工业株式会社)。

二、主要试剂与仪器

CD68(sc-9139)LOT# D0309兔源多克隆抗体；FoxP3(ab20034)LOT GR47679-2 鼠源单克隆抗体；SP9000通用性二抗检测试剂盒；Nikon80i荧光显微镜；JEDR801D形态图像分析系统等。

三、方法

1.手术方法：采用自身双眼对照的研究设计，右眼为实验组，行硅胶垫联合丝裂霉素C植入；左眼为对照组，行单纯硅胶垫植入。所有手术均由同一位术者操作完成。①术前准备：双眼使用氯霉素滴眼液点眼，3次/ d，共3 d，取MMC 2 mg溶于5 ml生理盐水中，配制成浓度0.4 mg/ml备用。将硅胶垫剪成9 mm×5 mm大小。②手术方法：苯巴比妥钠1 ml/kg耳缘静脉注射麻醉，双眼行常规消毒、铺巾，盐酸丙美卡因表面麻醉，取颞上象限做以穹隆部为基底的结膜瓣，充分分离球结膜及结膜下组织并暴露巩膜。实验组在球结膜下放置浸有MMC 0.4 mg/ml的棉片，放置3 min，8-0可吸收缝线将硅胶垫固定于浅层巩膜上，10-0非吸收线缝合球结膜；对照组行单纯硅胶垫植入术。术后常规使用左氧氟沙星滴眼液(原研)4次/d，普拉洛芬滴眼液4次/d。分别于术后10、30、90 d摘除眼球，每组各7只眼球。眼球摘除后，行甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色、masson染色等；免疫组织化学SP法检测TGFβ1、及αSMA。

2.结果判定：运用Nikon80i荧光显微镜观察组织形态、TGFβ1及αSMA的表达情况并拍照。TGFβ1的计数：在400倍视野下，随机选取5个视野计算阳性细胞数量的平均值。αSMA计数：在400倍视野下，随机选取5个视野，运用JEDR801D形态图像分析系统对图片进行数据统计，计算细胞的平均光密度的平均值。TGFβ1及αSMA阳性染色的成纤维细胞呈棕黄色着色。

结 果

一、 HE染色

实验组与对照组相比，组织的纤维化程度明显降低，但在术后10 d可观察到炎性细胞的表达较对照组多,见图1。

图1 HE染色法观察实验组与对照组中30 d时的组织纤维化程度及10 d时的炎性细胞。30 d时实验组(A)中组织纤维化程度明显低于对照组(B)；10 d时实验组(C)中的炎性细胞明显多于对照组(D)且组织纤维化程度低于对照组

二、 Masson染色：实验组组织切片中胶原纤维增生明显低于对照组,见图2。

图2 Masson染色观察实验组及对照组的胶原增生情况。90 d时，实验组(A)中胶原纤维增生明显低于对照组(B)

三、免疫组织化学SP法检测TGFβ1及αSMA

1.TGFβ1：实验组术后10、30、90 d的一个高倍镜视野下的阳性细胞数的平均值分别为15.80±2.39、28.20±1.48、41.60±2.70,对照组术后10、30、90 d的平均值分别为27.80±1.64、50.80±3.35、114.80±4.15,实验组与对照组在术后10、30、90 d的对比均具有统计学意义(P<0.01)。实验组中10、30、90 d的组间对比亦具有统计学意义；对照组中的组间对比同样具有统计学意义，见表1。TGFβ1在实验组与对照组中的阳性染色的成纤维细胞呈棕黄色，见图3。

表1 实验组与对照组以及两组间不同时间段TGFβ1阳性细胞数的比较

注：与对照组比较：**P<0.01

图3 实验组10 d(A1)、30 d(A2)、90 d(A3)TGFβ1阳性染色的成纤维细胞; 对照组10 d(B1)、30 d(B2)、90 d(B3)TGFβ1阳性染色的成纤维细胞(×400)

2.αSMA：实验组术后10、30、90 d的一个高倍镜视野下的平均细胞密度的平均值分别为0.169±0.010、0.519±0.031、0.877±0.033,对照组术后10、30、90 d的平均值分别为0.252±0.021、0.519±0.031、0.877±0.033,实验组与对照组在术后10、30、90 d的对比均具有统计学意义(P<0.01)。实验组中10、30、90 d的的组间对比亦具有统计学意义；对照组中的组间对比同样具有统计学意义,见表2。与TGFβ1的结果相一致。αSMA在实验组与对照组中的阳性染色的成纤维细胞呈棕黄色，见图4。

表2 实验组与对照组以及两组间不同时间段αSMA平均光密度的比较

注：与对照组比较：**P<0.01

图4 实验组10 d(A1)、30 d(A2)、90 d(A3) αSMA 阳性染色的成纤维细胞; 对照组10 d(B1)、30 d(B2)、90 d(B3) αSMA阳性染色的成纤维细胞(×400)

讨 论

难治性青光眼目前临床上常用的治疗方式有小梁切除术、睫状体冷冻术、Ahmed引流阀植入术。由于其眼前节结构紊乱，小梁切除术的成功率较低，仅为仅为11%～33%[3]；睫状体冷冻术因冷冻程度及范围难以准确把握，对视功能损害严重且可能导致眼球萎缩，故目前临床上常用的治疗方法为Ahmed引流阀植入术。

Ahmed青光眼引流阀植入术治疗难治性青光眼的疗效目前已得到认可，其手术失败的主要原因是术后的晚期并发症引流盘周围纤维化包裹。引流盘包裹，即引流盘与其周围的表层巩膜间形成的潜在的储液间隙消失，无法形成滤过泡，房水不能引流入眼眶周围组织，从而丧失了由毛细血管或淋巴管组织吸收而降低眼压的作用，房水引流不畅导致眼压再次升高、手术失败。引流盘周围组织纤维瘢痕化主要由巩膜表层、Tenon囊以及球结膜之间的成纤维细胞增生及胶原等为主的细胞外基质过度聚集所导致，其中成纤维细胞的激活、迁移、增殖是纤维组织增生、瘢痕形成的主要因素。因此临床上为减少术后引流盘纤维化包裹、提高手术成功率，MMC等抗组织代谢药物应用于手术中，但至今对于术中使用MMC能否提高手术成功率仍存在争议，有学者认为虽然术中使用MMC是安全且有效的，但与未使用MMC组相对比并没有提高术后早期及晚期成功率；而Kook MS等认为丝裂霉素C是有效的且未增加术后并发症[6]。相对的，MMC等抗代谢药物在临床青光眼小梁切术后的抗瘢痕形成的作用已基本得到肯定[7，8]。以此为基础来验证MMC在Ahmed青光眼引流阀中的抗瘢痕作用。

本实验选用HE染色、Masson染色直接观察组织的纤维化程度，同时采用免疫组化测定TGFβ1、αSMA量来间接评价组织的纤维化程度。TGFβ1是一能够强有力的促进成纤维细胞增殖的因子，能够直接或间接、独自或协同、同时或不同时作用于手术创口的修复细胞，以促进机体伤口的愈合。另外，其亦能够诱导成纤维细胞向肌纤维细胞转化，从而使细胞表达αSMA增多，αSMA为肌成纤维的标志性蛋白质，可以用其来准确的反应组织的纤维化程度[9]。

本组实验中分别选取10、30、90 d的HE及Masson染色的切片照片来直观的显示实验组与对照组纤维增生的程度，清晰的显示出实验组的纤维组织增生明显低于对照组。术后10、30、90 d实验组的TGFβ1及αSMA的表达均明显低于对照组，说明MMC可以有效的抑制成纤维细胞的增殖。另外，在本组试验中，实验组与对照组两组中，各组中的10、30、90 d的TGFβ1及αSMA的表达，两两之间的差异均具有统计学意义，说明成纤维细胞在术后的增生是逐渐增加的。

本实验显示，MMC在Ahmed引流阀植入术后具有明显的抗瘢痕形成作用。但由于未做青光眼模型，且硅胶垫植入无法形成滤过泡，所以无法对实验组及对照组术后的滤过泡的形态及眼压进行观察和对比，只能间接的评估MMC在Ahmed青光眼引流阀植入术后的炎症反应及成纤维细胞增生的情况。

[1] 丁碧青，程萍，陶黎明．Ahmed引流阀植入术治疗难治性青光眼临床疗效分析．安徽医科大学学报，2013，48：100-102.

[2] 吕旭东，刘晟.Ahmed青光眼阀植入联合手术治疗难治性青光眼临床分析.临床眼科杂志，2006，14:121-122.

[3] 孙兴怀．难治性青光眼的治疗．国外医学眼科学分册，1995，19:26-31.

[4] Costa VP, Azuara-Blanco A, Netland PA, et al. Efficacy and safety of a djunctive mitomycin C during Ahmed Glaucoma Valve implication: a prospective randomized clinical trial. Ophthalmology, 2004，111:1071-1076.

[5] Kurnaz E, Kubaloglu A, Yilmaz Y, et al. The effect of adjunctive Mitomycin C in Ahmed glaucoma valve implication. Eur J Ophthalmol, 2005，15:27-31.

[6] Kook MS, Yoon J, Lee MS. Clinical results of Ahmed glaucoma valve implantation in refractory glaucoma with adjunctive mitomycin C.Ophthalmic Surg Lasers, 2000，31:100-106.

[7] 王亚丽，李拓，李家璋，等．丝裂霉素C联合复合式小梁切除术治疗难治性青光眼疗效．国际眼科杂志，2016,16：547-549.

[8] 马瑞倩，杜驰，陈敏瑜．撕裂霉素在销量切除术中的应用效果．中国现代医学杂志，2015，17：10-12.

[9] Muchaneta-Kubara EC, Nahas AM, Myofibroblast phenotypes expression in experimental renal scarring. Nephrol Dial Transplant.1997，12:94-95.