高效液相色谱-原子荧光光谱(HPLC-AFS)法测定水产动植物样品中无机砷

刘海涛 姚梦楠 薛慧 闫京山 王俊杰

（北京海光仪器有限公司，北京100016）

前言

砷元素广泛存在于自然界中，尤其在食品安全和环境领域，越来越受到社会的广泛重视，作为重金属元素之一的砷，已成为食品安全重点检测的项目。经过大量食品中砷的检测发现，海产品中砷的含量普遍高于陆地生长物种[1]，有些要高出陆地物种好几倍，其中典型代表就是海藻类植物，如海带、紫菜、羊栖菜等本身具有很强的吸附特性，会富集大量的砷。然而，我们常以藻类或其它海产品为食，造成大量中毒现象却没有发生。后来，经过大量实验研究，发现海产品中存在的砷形态与陆生物种不尽相同，其大多存在砷形态为有机砷，例如砷糖、砷甜菜碱、砷胆碱等，其毒性很弱，甚至有报道研究为无毒砷形态；而毒性很强的无机砷含量比较低。所以我们在分析此类产品砷含量时，要加以区分有毒和无毒砷形态，制定出行之有效的检测方法。

目前国内新修订现行的食品中无机砷检测国家标准GB5009.11—2014方法中采用联用方法分析测定无机砷[2]。目前GB5009.11—2014中规定此类产品中无机砷采用液相色谱梯度洗脱，分离有机砷和无机砷，以达到消除有机砷对无机砷测定干扰的目的。样品提取方法中，砷糖等有机砷以及提取过程中的中间有机砷产物可能和三价砷在色谱分离出峰位置上距离较近，有些难以分开，经研究发现，尤其藻类等植物体内含有大量砷糖类化合物，会干扰三价无机砷检测。而动物类产品中含有大量砷胆碱、砷甜菜碱等有机砷物质，此类砷化合物在通常条件下很难发生氢化物反应，原子荧光不会检出信号，因此不会对无机砷造成干扰，动物类样品用等度洗脱分离完全可以满足无机砷的检测。本文重点在于对植物样品无机砷检测方法进行研究，样品前处理方法加以改进。

当前标准中，梯度洗脱就是利用较低强度的缓冲液流动相将前期出峰的色谱图完全分开，不干扰三价无机砷的检测。然而液相梯度分析过程比较繁琐，出峰时间长，需要二元高压泵或其它带有梯度模式色谱泵才能实现，对操作人员和技术要求均较高，尤其对于广大从事无机元素分析的人员来说，操作更为困难。本文提出一种新的测定方法，对梯度法进行改进，仅用等度液相泵就可以完成分析过程。本文实验用最佳的样品提取酸度和温度，样品处理后，为解决三价砷出峰位置和有机砷干扰重合问题，加入一定量的H2O2氧化三价砷到五价砷，这样测定五价砷的量即为总的无机砷含量。本方法既解决了三价砷和有机砷难以分开问题，又可以使用简单的等度液相洗脱方法分离砷形态，使得分析样品时间大大缩短，较好解决了此类样品中无机砷的检测问题。

1 实验部分

1.1 仪器和材料

LC-AFS9560液相色谱-原子荧光光谱联用仪（北京海光仪器有限公司）；液相色谱自动进样器（Spark Holland）；超声波振荡器；漩涡混合器；高速离心机；恒温水浴震荡器；溶剂过滤器。阴离子交换色谱柱（汉密尔顿），阴离子保护柱（汉密尔顿）。

盐酸（优级纯）、硝酸（优级纯）、硼氢化钾（KBH4）、氢氧化钠（NaOH）、甲醇（色谱纯）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、甲酸、正己烷，三价砷As（Ⅲ）、五价砷As（V），均为标准物质，购于中国计量院，一甲基砷[CH3AsO（ONa）2·6H2O，MMA，标准物质，购于中国计量院]、二甲基砷[（CH3）2AsO2H，DMA，标准物质，购于中国计量院）、氩气（纯度≥99.99%）、0.45μm滤膜。，除另有说明外，所用试剂均为优级纯，实验用水应符合国家标准中规定的一级水。

1.2 样品处理

1.2.1 水产动物样品

取水产动物样品可食部分进行粉碎匀浆，称取匀浆后样品1.0 g（或干样0.2～0.5 g）（精确至0.000 1 g），置于50 m L离心管中，加入20 m L HNO3（0.15 mol/L）作提取剂，在漩涡混合器上充分混匀。于90℃水浴下恒温震摇浸提2.5 h，每半小时摇匀1次。提取结束，需冷却到室温，于离心机5 000 r/min下离心20 min。取10 m L上层清液置于离心管中，加入10 m L正己烷，用力振摇1 min后，除去脂肪及大量有机物，舍弃上层液体。于离心机5 000 r/min下再离心20 min。按此过程重复萃取一次，舍弃上层液体，用滴管吸取下层清液，依次用C18小柱净化及0.45μm有机滤膜过滤后进样。

1.2.2 水产植物样品

称取1.0 g（精确至0.000 1 g）海藻类干样于50 m L离心管中，加人20 mLHCl（1.0%）提取剂，在漩涡混合器上充分混匀，于90℃水浴恒温震摇浸提2.5 h，提取完毕，需冷却到室温，于离心机5 000 r/min下离心20 min。滴管吸取上层清液用0.45μm有机滤膜过滤，取0.5 mL滤液，加入0.2 m L过氧化氢（H2O2），用水稀释定容至2.0 m L，摇匀后于70℃水浴下恒温氧化20 min，将三价砷氧化为五价砷，取出冷却至室温，上机测定，最终通过对五价砷的测定得到样品中总无机砷含量。对于无机砷含量较低的水产植物类样品，可直接吸取1.8 m L上清液加人0.2 m L双氧水，直接氧化，摇匀后，于70℃水浴下恒温氧化20 min，取出冷却至室温，上机测量。过氧化氢加入量为确定定容体积的10%。样品和提取液中总砷的分析测定，参考《食品中总砷及无机砷的测定》（GB/T5009.11—2014）[2]。

1.3 仪器工作条件选择

实验中具体条件见表1。

表1 无机砷测定的LC-AFS条件Table 1 LC-AFS of inorganic arsenic detection conditions

1.4 标准溶液制备

砷的混合标准储备溶液需要相应的MMA、DMA、Asバ和As（V）标准物质稀释得到，砷的混合标准工作溶液，由于溶液稳定性易受环境影响，容易转化，需要现用现配，本实验配制成10、20、40、80、100μg/L的浓度曲线。在优化好的仪器实验条件下，计算拟合标准曲线，混合标准分离色谱图见图1，线性方程见表2。

2 结果与讨论

2.1 流动相选择

图1 不同浓度砷形态分离谱图Figure 1 Chromatogram of arsenic in different concentrations.

分别对磷酸二氢钠、流动相磷酸二氢铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾混合液作为流动相进行选择实验，选取最佳分离条件[6-7]。以磷酸二氢钠（10 mmol/L）溶液为流动相，p H值为9.0进行分离测定时，分离效果较好，但DMA和Asバ信号强度低，分析时间较长；以磷酸二氢铵（15 mmol/L）溶液为流动相，调节p H值为6.0进行分离测定时，砷各形态出峰时间均较长，DMA和As（V）信号强度较低，分离效果较好，见图2；以磷酸氢二钠和磷酸二氢钾混合液为流动相，p H值为5.92进行分离实验时，砷4种形态在6 min内完全分离，峰形尖锐，且信号强度高，见图3，因此实验选择磷酸氢二钠和磷酸二氢钾混合液作为流动相。

表2 砷形态曲线回归方程Table 2 Regression equation of arsenic speciation curve

2.2 提取剂及浓度选择

提取剂是保证样品中砷形态提取效率的前提，也是制约本实验方法准确度的关键。目前，海产品中砷形态常用的提取剂主要有水、酸、和碱[7]，经过实验比较，稀酸为良好的砷提取剂，通常首选盐酸体系。选择无机砷含量较高的样品羊栖菜为研究对象，称取1.0 g干样（精确至0.000 1 g，粉碎均匀后使用），采用不同浓度酸进行提取实验，比较研究了在0.5%～50%盐酸溶液范围内，90℃水浴下恒温震摇2.5 h后测定。考虑到羊栖菜中无机砷含量可能偏高以及色谱柱的耐酸程度，提取完毕后，将实验中各盐酸浓度浸提液稀释10倍后上机测定，无机砷含量结果见表3。

重点研究不同浓度盐酸溶液对无机砷提取率的影响，由图4可知，提取剂盐酸浓度在0.5%～50%范围，测得无机砷含量变化在29.68～31.25 mg/kg，当盐酸浓度在1.0%～40%范围变化时，相对于其它浓度提取的无机砷效率较高，通过提取率实验可知，较低浓度盐酸已完全将羊栖菜等藻类植物中的无机砷提取。考虑到阴离子交换色谱柱耐酸性较差，没有对大于50%的高浓度盐酸实验。同时为减小稀释倍数过大带来的测量误差，有利于低浓度样品的检出，因此提取剂的浓度选用浓度较低的盐酸（1.0%）溶液，测定结果见表3。

2.3 氧化剂加入对中间产物影响

氧化剂的使用可以完全将三价砷氧化成五价砷，但是，氧化剂会不会对样品中的有机砷产生影响呢，也许会存在有机砷向无机砷转化的过程，也会造成对五价砷测定的干扰。带着这样的疑问，本实验重点研究氧化剂对于有机砷的干扰问题。许多实验研究发现，使用酸浸提会使样品中大分子有机砷，如砷糖，砷脂类等分解转化为小分子有机砷，DMA、MMA等。为了验证用盐酸（1.0%）提取剂提取样品，大分子有机砷及中间产物是否受氧化剂影响，分别进行了加标回收和对比实验。在样品中加入DMA和MMA标准溶液，按样品处理方法进行酸提取及H2O2氧化的全过程，然后上机测定，结果DMA和MMA的加标回收率均在90%～105.0%，五价砷的含量没有增加，说明样品中的有机砷或中间产物DMA和MMA在酸提取及H2O2氧化过程中不会转化为无机砷，不会对无机砷的测定造成干扰。加入氧化剂H2O2只会氧化三价砷到五价砷，图5（a）为空白样品中加入无机砷和DMA、MMA标准溶液谱图，图5（b）为经过氧化后测试谱图，有机砷DMA和MMA无变化，三价砷被氧化为五价砷。

表3 羊栖菜样品在不同盐酸浓度下砷的提取率和无机砷含量Table 3 The extraction rate of Sargassum samples in different concentration of hydrochloric acid and arsenic and inorganic arsenic /(mg·kg-1)

图4 不同提取酸度下无机砷测定值Figure 4 Determination of different extraction acidity of inorganic arsenic.

2.4 氧化剂加入量的影响

既然选择加入过氧化氢来氧化三价无机砷到五价砷[8]，可以解决海产品有机砷对于三价砷干扰问题，本实验继续对氧化剂加入量以及氧化时间进行探索，在样品提取液中分别加入5%、10%、20%、30%、40%、50%不同比例过氧化氢，按同一条件70℃恒温水浴20 min，冷却后测定，结果表明，10%～50%的氧化剂氧化后，测得的总无机砷量无变化（见表4），说明10%氧化剂量足以将三价无机砷完全氧化到五价砷，所以实验选择氧化剂为过氧化氢（10%）。同时还对水浴温度对氧化效率进行了实验，实验不同温度50～90℃下影响，结果表明，温度越低，完全氧化需要时间较长，提高温度有助于快速氧化，但考虑到温度过高，过氧化氢会分解，且过氧化氢氧化能力很强，最快15 min就能氧化完全，综合考虑，实验最终选择10%氧化剂量，水浴温度70℃，氧化时间20 min较好。羊栖菜样品氧化后见图6、图7。

图5 有机砷氧化过程转化实验对比Figure 5 Comparison of conversion experiments of organic arsenic oxidation process.

图6 羊栖菜氧化实验图Figure 6 The chart of oxidation experiment of sargassum.

2.5 方法准确度及精密度实验

实验分别以动物性海产品和藻类产品为测定对象，藻类样品提取液测试前加入过氧化氢氧化后测定，进行精密度实验和加标回收实验。分析样品采用超市和市场上常见的海产品进行分析，国家食品污染物限量[3]标准对于海产品中无机砷限量要求小于0.5 mg/kg，采集样本后，处理前分别添加0.5 mg/kg和1.0 mg/kg无机砷标准物质进行实验，实验结果见表4。实际样品分析平均加标回收率都在85%～105%，每个样品平行三个，相对标准偏差RSD小于5%。实验结果表明，联用分析方法可以满足无机砷检测需求。分析结果见图8。

图7 不同过氧化氢含量下无机砷测定值Figure 7 Determination of hydrogen peroxide content under different inorganic arsenic.

图8 实际样品及加标谱图Figure 8 The spectrum of actual sample and standard.

表4 样品测试结果Table 4 Sample test results /(mg·kg-1)

3 结论

采用液相色谱-原子荧光光谱联用分析方法对原有无机砷检测方法进行改进研究，证明了原有海产品无机砷检测方法的主要问题在于需要运用梯度洗脱方式才能有效分离样品中的有机和无机砷形态，过程比较繁琐，分析周期较长，且对于仪器操作者和仪器设备均提出较高要求。本文对当前方法进行改进，尤其对藻类等植物样品处理上，通过加入氧化剂氧化三价砷方式和干扰有机砷分离，而且实验过程中也证明了有机砷不会向无机砷转化，不会对无机砷测定产生干扰。本实验方法的改进证明可以应用于海产品中无机砷的检测。

[1]中华人民共和国卫生部.GB 19643—2005藻类制品卫生标准[S].北京：中国标准出版社，2005.

[2]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.11—2014食品中总砷及无机砷的测定[S].北京：中国标准出版社，2014.

[3]中华人民共和国卫生部.GB 2762—2012食品中污染物限量[S].北京：中国标准出版社，2012.

[4]刘桂华，汪丽.HPLC-ICP-MS在紫菜中砷形态分析的应用[J].分析测试学报（Journal of Instrumental Analysis），2002，21（4）：88-93.

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[6]陈少波，余雯静，赵玉兰.食品中砷形态分析及无机砷测定[J].农产品加工（Agricultural Products Processing），2013，314（4）：80-86.

[7]高继庆，林洪，张秀珍，等.原子荧光光谱法检测海藻中无机砷含量[J].分析试验室 （Chinese Journal of Analysis Laboratory），2008，27（5）：111-114.

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