柱前衍生反相高效液相色谱法测定山黧豆中的毒素β-ODAP

李改弟

（四川会理铅锌股份有限公司，四川 会理615100）

前言

山黧豆，是一种栽培历史悠久的豆类饲料作物，一年生，盛产于印度、欧洲、非洲及亚洲东部。我国所产山黧豆是从国外引种，分布于甘肃、陕西、新疆等地。山黧豆具有广泛的适应性，耐寒、耐旱，在干旱年间其它豆类及谷物作物都欠收时，它仍能维持较高的产量，而且山黧豆营养丰富，种子中蛋白含量高达26%～30%，蛋白水解产物含17种主要氨基酸，特别适合我国西北干旱地区种植。但是，有记载称，过多食用会引起山黧豆中毒：主要症状为尿频，下肢无力，足跟不易抬起，再度发展即可发生下肢瘫痪[1]。山黧豆中含有的一种非蛋白质氨基酸，β-草酰基-L-α，β-二氨基丙酸（β-ODAP）[2]是山黧豆引起中毒的成分，妨碍了山黧豆的推广和种植。因此研究和建立快速，准确，灵敏度高，选择性好的分析方法非常重要。

目前，国内外学者已经在β-ODAP的分离鉴定、化学及生物合成、分析方法、毒理学，代谢机理等方面做了大量工作[3]。β-ODAP的分析方法很多，如以前的纸层析法[4]，薄层层析法[5]，邻苯二甲醛法以及最近的高效液相色谱法等[6]。

参照三七素的测定方法[7]，用预冷研磨独特的冷冻抽提技术进行样品的预处理，用乙腈和HAc-Na Ac缓冲溶液作流动相，等度洗脱，目标峰分离度高，峰形好，且使β-ODAP目标峰最先出峰（t=3.62 min），使样品的分析时间大大缩短，有利于大量样品的分析。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司），Luna-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；电热恒温水浴锅（H H.S21-Ni6），真空干燥箱（D2F-6021），电子天平（FA2204B），冷冻离心机（TGL-20M，高速台式），全自动新型鼓风干燥箱（ZRD-7080）。

2，4-二硝基氟苯（分析纯），乙腈（色谱纯），冰醋酸、碳酸氢钠、无水乙酸钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾，山黧豆。

1.2 色谱条件

色谱柱[Luna-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）]，流动相[乙腈∶HAc-Na Ac缓冲溶液（17∶83）]），柱温（40℃），检测波长（360 nm），流速（1.00 mL/min），进样量为20μL。

Na HCO3溶液（0.5 mol/L），2，4-二硝基氟苯的溶液（FDNB，10.0 mg/mL），标准样品溶液（1 mg/m L），磷酸盐缓冲溶液，HAc-Na Ac缓冲溶液。

1.3 样品处理

称取山黧豆的种子、根、茎、叶各1 g（精确至0.001 g平行3份），放置于-40℃的冰箱中冷冻保存。取出用在-20℃冰箱中冷冻过的研钵研磨，然后分别加入适量石英砂和7.0 m L乙醇（30%）作为抽提液，研至均匀后静置3 min。

取其上清液1.0 m L置离心管中于-4℃下冷冻离心15 min。将上述样品置于65℃恒温真空干燥28 h，全部烘干。向样品中加入0.1 m L Na HCO3溶液，震荡，使其充分溶解。再加入0.1 m L FDNB溶液，在60℃恒温水浴中进行衍生反应，0.5 h后取出，冷却至室温。加入0.8 m L磷酸盐缓冲溶液（PBS），用0.45μm的有机相滤头过滤，取其滤液依次进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱图分析

参考已有学者的研究成果[6]，首先选择了乙腈和H3PO4-KH2PO4缓冲溶液作为混合流动相，但是实验条件不稳定，色谱峰峰形差，目标峰分离效果不好，并且流动相在溶剂瓶的滤头处易结晶，形成堵塞。因此改用乙腈和HAc-Na Ac缓冲溶液作为混合流动相，获得了较好的峰形且达到基线分离，故实验采用乙腈和HAc-Na Ac缓冲溶液作为混合流动相。实验中流动相乙腈∶HAc-Na Ac缓冲溶液配比定为17∶83。

2.2 衍生试剂配比的选择

在衍生实验中，FDNB加入量随分析物的种类和浓度不同而不同，参照已有实验条件[7]和初步实验的基础上，选择了2，4-二硝基氟苯（FDNB）作为衍生试剂，图1是衍生试剂FDNB衍生后的色谱图。实验发现，衍生配比在1∶1～1∶15时，色谱峰峰面积呈现显著增大的趋势；在1∶15～1∶30时，色谱峰峰面积变化不显著。图2、图3、图4是β-ODAP与FDNB配比分别为1∶12、1∶15、1∶18的色谱图，从图2和图4对比可知，随着FDNB浓度增大，峰面积有所增加，但都有杂峰。故实验选择1∶15的衍生试剂配比。

图1 衍生剂FDNB的HPLC图Figure 1 HPLC chromatogram of derivative agent FDNB.

图2 β-ODAP与FDNB的配比为1∶12的HPLC图Figure 2 HPLC chromatogram ofβ-ODAP ratio of 1∶12 with FDNB.

图3 β-ODAP与FDNB的配比为1∶15的HPLC图Figure 3 HPLC chromatogram ofβ-ODAP ratio of 1∶15 with FDNB.

3 山黧豆样品的测定

3.1 线性范围和校准方程

在选定的色谱条件下，β-ODAP色谱峰的峰面积与其浓度在0.007～1.000 mg/m L范围内呈现良好的线性关系，结果列于表1。校准方程为y=5 164x+167.74，相关系数R2=0.993 9，根据所测结果，绘制校准曲线如图5所示。

3.2 样品测定结果

在选定的色谱条件下，对山黧豆的不同部位进行测定，结果列于表2和表3。

图4 β-ODAP与FDNB的配比为1∶18的HPLC图Figure 4 HPLC chromatogram ofβ-ODAP ratio of 1∶18 with FDNB.

表1 β-ODAP标准溶液的测定结果Table 1 β-ODAP measurement result of the standard products

图5 β-ODAP含量与峰面积线性关系Figure 5 The linear relationship of the β-ODAP content and the peak area.

由表3可知，山黧豆不同部位中种子的β-ODAP含量最高。

4 精密度与准确度实验

取β-ODAP标准样品（0.70 mg/m L）衍生溶液重复进样5次，测β-ODAP浓度，计算RSD值，平均回收率（表4）。

表2 山黧豆不同部位中β-ODAP的保留时间和峰面积Table 2 The retention time and peak area ofβ-ODAP in different parts of Lathyrus

表3 山黧豆不同部位中β-ODAP的含量Table 3 The content ofβ-ODAP in different parts of Lathyrus

表4 精密度与准确度实验Table 4 Results of precision test

由表4可知测定山黧豆中β-ODAP峰面积的相对标准偏差（RSD）为1.6%，即精密度良好。平均回收率为99.0%，即准确度良好。

5 结论

通过实验可知，采用高效液相色谱法测定β-ODAP具有操作简单、精密度好、选择性好，无需其它辅助设备等优点，完全符合氨基酸的分析要求。另外，本法采用2，4-二硝基氟苯（FDNB）作为衍生试剂，保证衍生物有足够的稳定性，无需快速进样检测，尤其是可应用于水相检测，还可应用于其它氨基酸的检测和分析中。

[1]覃新程，李志孝，王亚馥.山黧豆及其神经毒素（ODAP）的研究进展[J].生命科学（Chinese Bulletin of Life Sciences），2000，12（2）：52-56.

[2]严则义，邢更妹，王崇英，等.家山黧豆及其毒素ODAP的研究[J].西北植物学报（Northwest Journal of Botany），2004，24（5）：911-920.

[3]严则义.山黧豆毒素ODAP与草酸的测定方法及其代谢关系的研究[D].兰州：兰州大学，2004.16-30.

[4]李志孝，蔡文涛.山黛豆毒素—BOAA纸层析扫描测定[J].兰州大学学报（自然科学版）[Journal of Lanzhou University（Natural Science Edition）]，1986，22（2）：76-80.

[5]焦成瑾，杨玲娟，雷新有，等.山黧豆毒素的薄层分离[J].氨基酸和生物资源（Amino Acids and Biotic Resources），2007，29（4）：76-80.

[6]张海霞，刘满仓，靳小舜，等.2，4-二硝基氟苯柱前衍生测定山黧豆毒素β-ODAP[J].分析化学研究简报（Chinese Journal Anaytical Chemistry），2006，34（1）：100-102.

[7]杨玲娟，高二全，焦成瑾.柱前衍生HPLC法测定三七中的三七素[J].资源开发与市场（Resource Development and Market），2015，31（1）：1-4.