miR-204在肺癌组织中的表达与临床病理的关系

潘兆宝 吉华青 韩丽芳 董安山 史立宏

261000潍坊市第二人民医院1

261000潍坊医学院2

本研究特对78例肺癌组织和癌旁正常组织进行对照研究，以期明确miR-204在肺癌组织中相对表达及其与临床病理的关系，为该基因表达在肺癌发病过程中作用机制研究奠定基础。

资料与方法

研究设计：本研究采用前瞻性、空白对照方法设计、开展试验探究。

研究对象：选取我院2014年6月-2016年4月行肺癌切除术的78例石蜡存档组织标本作为研究对象。取肺癌组织作为试验组，取癌旁正常组织(距癌症组织≥3 cm)作为对照组。78例患者均为原发性肺癌，且符合孙丽慧2011年《现代肿瘤学》中肺癌相关诊断标准[3]，其中男42例，女36例；年龄45～72岁，平均(58.72±5.13)岁；病程1～30个月，平均(16.78±5.04)个月；肿瘤长径2.0～7.7 cm，平均(4.32±0.71)cm；淋巴结转移23例，无55例；TNM分期为Ⅰ期32例，Ⅱ期25例，≥Ⅲ期21例；分化程度为高分化27例，中分化29例，低分化22例；组织类型为鳞癌39例，腺癌19例，非小细胞癌14例，其他6例。

入选标准：①所有患者均为原发性肺癌，术后经病理检查证实；②均行根治性切除术，且符合手术指征；③切除组织均行石蜡存档处理。

排除标准：①其他类型原发性恶性肿瘤，肺部转移者；②肺部良性肿瘤者；③合并其他严重系统性疾病者。

试剂和仪器：Trizol RNA提取试剂盒(购自美国Invitrogen公司)；荧光定量RT-PCR反转录和定量染料(均购自大连Takara宝生物工程公司)；miRNA探针和引物(购自美国ABI公司)；台式离心机(TDM5L型，购自湖南湘仪仪器公司)；超低温冰箱(MDF-U53V型，购自日本Sanyo集团)；RNA评估系统(Agilent 2100型，购自安捷伦科技公司)；荧光定量RT-PCR仪器(7900HT型，购自美国ABI公司)；miR-204逆转录引物序列(由美国ABI公司设计并合成)。

miRNA提取方法：采用Trizol提取总RNA，具体方法如下：①取试验组和对照组组织，逐渐添加液氮同时将其研磨，依次加入Buffer-Ⅰ裂解液和Buffer-Ⅱ裂解液，注意此过程中需要抽提；②行离心分离处理，将沉渣撇去后添加无水乙醇，并行离心处理，去滤液并将其中加入异丙醇，离心分离后将上清液撇去，添加浓度70%的乙醇，放置-20℃的恒温冰箱中预冷后行离心分离处理，将上清液撇去，上述所有离心分离过程中转速均设置为12 000 r/min，时间5 min；③将沉淀采用Buffer TE水洗脱miRNA，保存备用。

荧光定量RT-PCR检测方法：①取上述步骤所得样品5 μL，向其中加入miR-204逆转录引物并行扩增实验；②内参设置为U6RNA，反应总体积10 μL(需用无RNA酶H2O将反应体系补充至10 μL)；③PCR反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性10 s，58℃水浴20 s，完成45个循环后，72℃退火30 s。在此过程中需注意将内参U6RNA进行扩增以作为对照；④取裂解液PLB，用超纯水稀释5倍后加入反应体系终止反应后加入LA工作液100 μL，并采用荧光系统对miR-204表达荧光相对含量进行检测。

观察指标和判定标准：①对比试验组和对照组miR-204表达荧光相对含量；②对比不同临床病理条件下miR-204表达荧光相对含量。

统计学处理：采用SPSS 17.0分析，计量资料采用(x±s)表示，采用t检验；计数资料采用率(%)表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

试验组和对照组miR-204表达荧光相对含量比较：试验组miR-204表达荧光相对含量水平较对照组显著降低，两组数据比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 两组miR-204表达荧光相对含量比较(x±s)

两组miR-204荧光相对含量水平检测图(略)。

不同临床病理条件下miR-204表达荧光相对含量比较：miR-204表达荧光相对含量在性别、年龄方面比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，而在病程、肿瘤长径、淋巴结转移、TNM分期、分化程度和组织类型等不同临床病理条件下其荧光相对含量水平差异有统计学意义(P＜0.05)，其中病程≥12个月、肿瘤长径≥5 cm、淋巴结转移、TNM≥Ⅲ期、低分化和非小细胞肺癌miR-204表达荧光相对含量水平均远低于病程＜12个月、肿瘤长径＜5 cm、无淋巴结转移、TNMⅠ期和Ⅱ期、高分化和中分化、鳞癌和腺癌等含量水平，见表2。

表2 不同临床病理条件下miR-204表达荧光相对含量比较(x±s)

讨 论

目前临床上对肺癌发生和进展作用机制研究尚浅，仅有既往相关研究证实抽烟、药物作用、生活和社会环境压力增大等均是肺癌发生的危险因素。随着分子生物学和医疗技术水平的不断发展和进步，基因突变成为当前公认的癌症发生的根本原因，且临床上针对肺癌患者采用放化疗有效性和敏感性均和多种相关基因表达水平存在关联[2，3]。目前关于肺癌遗传易感性和放化疗有效性研究较多的基因，当属BCL-2、HMGA2、DHH、DTX1等，均有实验动物模型或体外细胞实验证实其可能参与肺癌的发生和发展过程[5-6]。相关研究指出，上述基因在胃癌中也可能具有重要参与作用，通过对miRNAs作用调控相关蛋白表达和功能，进而诱导并促进胃癌发生，其中以miR-204作用最为明显[7]。因此探究miR-204在肺癌组织中表达水平及其和临床病理的关系，对确定其是否参与肺癌发生和进展、明确其作用机制具有至关重要的意义。

miR-204具有多种生物学作用，在人体9号染色体上，对骨髓基质细胞和骨髓间质母细胞的分化均具有重要调控作用。在不同类型的肿瘤发生过程中，miR-204表达水平和调控机制存在明显不同。国外报道指出[8，9]，miR-204可以显著抑制致癌相关蛋白水平，但是在子宫内膜样癌、宫颈癌、卵巢癌等多种妇科恶性肿瘤中其表达水平均表现出显著降低趋势，提示miR-204对多种妇科恶性肿瘤具有显著抑制作用，推测其靶基因很可能是具有积极作用，能够增强放化疗有效率的抑癌基因。另有研究通过体外人胆管癌细胞系miR-204培养和检测研究[10]，结果发现外源性的miR-204能够显著增强癌细胞凋亡率，且激发化疗药物5-氟尿嘧啶的疗效，且Bcl-2蛋白表达水平显著被抑制，推测和Bcl-2受到miR-204负向调控作用有关。在一项关于食管鳞状细胞癌组织的研究中发现[11]，miR-204过表达可显著抑制病情恶化和进展，对抑制迁移、侵袭、浸润均具有显著调控作用。

本研究结果中，试验组miR-204表达荧光相对含量较对照组显著降低，且在病程、肿瘤长径、淋巴结转移、TNM分期、分化程度和组织类型等临床病理条件下其表达水平均差异存在统计学意义，提示miR-204低表达不仅和肺癌的发生关系紧密，对其侵袭、转移、浸润也很可能存在一定调控作用。但是其具体作用机制尚需深入探究，期待更多学者积极探索，为肺癌临床防治提供更为合理、高效的方案。

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