“调宗气”组方对慢性间歇性低氧老年大鼠颏舌肌钙离子浓度的影响

130021长春中医药大学附属医院

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)是一种常见的呼吸疾病，表现为睡眠过程中反复发生上气道阻塞，导致通气降低或停止，同时可伴有低氧血症[1]。OSAHS患者可出现白天困倦、乏力、注意力不集中、头晕、胸闷、心慌、性功能减退等多脏器、多系统功能损害，严重影响患者的生活质量[2-6]。本课题组以“调宗气”理论为基础运用自主设计的汤方、外用塌渍、针灸治疗OSAHS，已取得了成效。上气道扩张肌活性异常在OSAHS发生、发展中起着重要作用，而颏舌肌为上气道最主要扩张肌，经临床和基础研究证实，其功能异常可导致上气道闭陷而引发疾病。因此，本研究拟通过“调宗气”理论指导下组方对慢性间歇性缺氧大鼠颏舌肌钙离子浓度影响的研究，找到“调宗气”法有效治疗OSAHS的作用机理，为寻找更加有效的治疗方法提供科学依据，将“调宗气”这一独特中医理论充分运用并有效指导临床治疗。

资料与方法

实验动物：实验选取健康Wistar大鼠，雄性，体重220～250 g，10只；体重350～400 g，50只，由辽宁长生生物技术有限公司提供，动物合格证号为SCXK(辽)2015-0001。在长春中医药大学研发中心饲养，饲养条件为室温18～22℃，湿度50%～70%，自然光照，大鼠正常饲养，每5只一笼，自由饮食。

药品与试剂：调宗气汤方药物组成：黄芪，党参，陈皮，法半夏，茯苓，白术，炙甘草，苏子，莱菔子，地龙等。购自于长春中医药大学附属医院免煎室，由长春中医药大学研发中心制作。

Ca离子浓度比色法定量检测试剂盒：规格为96T，美国GENMEDSCIENTIFICS INC产品，批号为20160601。

实验气体：医用氧气与高纯度氮气，浓度＞99.99%，由长春市医巨洋气体提供。

实验仪器：低氧动物舱由本实验室联合长春市雨润农业技术有限公司制作；大鼠转棒疲劳仪型号为ZH-YLS-4C，安徽正华生物仪器设备有限公司产品；电子天平型号为YP1201N，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；可调高速匀浆器为FSH-2A型，江苏省金坛县望华科较仪器厂产品；贺利氏(Heraeus)台式离心机Stratos型号Biofuge Stratos，德国贺利氏公司产品；紫外/可见分光光度计型号为Lambda25，美国Perkin Elmer公司产品。

实验方法：①中药的制作：调宗气汤方药物组成：黄芪，党参，陈皮，法半夏，茯苓，白术，炙甘草，苏子，莱菔子，地龙等。将上述中药免煎提取物溶于83 mL的蒸馏水中备用。②实验分组及给药处理方法：实验选取清洁级健康Wistar大鼠，雄性，体重220～250 g，10只，作为青年鼠对照组；实验选取清洁级健康Wistar大鼠，雄性，体重350～400 g，50只，按体重随机分为5组，每组10只动物，分别为老年鼠对照组、老年鼠模型组、中药组、中药+运动组、中药+运动+吸氧组。青年鼠对照组、老年鼠对照组、老年鼠模型组动物给予1 mL/kg·d蒸馏水灌胃；中药组动物给予23.33 g/kg·d中药灌胃，该给药剂量约为该药物临床每天使用等效剂量的2倍；中药+运动组动物给予23.33 g/kg·d中药灌胃后，强迫其于大鼠转棒疲劳仪中运动30 min/d；中药+运动+吸氧组动物给予23.33 g/kg·d中药灌胃，强迫其于大鼠转棒疲劳仪中运动30 min/d后，置于低氧动物舱吸纯氧气30 min/d。

慢性间歇性缺氧模型的建立(参照袁氏和Fletcher方法并改进[7])：①低氧动物舱的建立：用7 mm厚有机玻璃制成长方体舱，规格120 cm×60 cm×60 cm，上配可打开密封盖，用于取放动物，侧壁留一个小孔，直径20 mm，用作输入浓度99%氮气，两端分别安装直径160 mm的电动风阀各1个，其中一端安装风机，用于缺氧舱内气体排出及空气吸入。试验过程中将舱内水蒸气和二氧化碳分别用硅胶干燥剂和生石灰吸收。②气体控制通路：设计由单片机程序控制定时电磁转换器、电动风阀及风机开关，控制氮气输入和空气吸入，每个循环过程120 s，即充入60 s氮气，随后利用风机与电动风阀将舱内气体排出并吸入60 s空气。③慢性间歇性缺氧实验：将老年鼠模型组、中药组、中药+运动组、中药+运动+吸氧组大鼠分别置于慢性间歇性低氧舱内，紧闭舱门，循环充入氮气和压缩空气。该循环每天重复8 h(8:30-16:30)，共持续5周。采用数字式测氧仪持续检测慢性间歇性缺氧舱内FiO2，及时调节气体流量，使每一循环过程中舱内最低FiO2达到5%～6%，随后逐渐恢复至21%，以使大鼠平均动脉最低血氧饱和度在0.60～0.80。青年鼠对照组、老年鼠对照组大鼠常规饲养，不予任何处理。数字式测氧仪检测结果为舱内FiO2在输入氮气后逐渐减低至5%～6%，持续约6～10 s，随着压缩空气输入，FiO2逐渐升至20%～21%。各组动物于造模当日起每日灌胃及处理1次，连续5周。

检测指标：于5周末给药30 min后，各组动物经20%乌来糖溶液(5 mL/kg)麻醉后处死。剖取大鼠颏舌肌组织，按每克颏舌肌组织加9 mL生理盐水，制成10%组织匀浆，3 000 rpm离心10 min，取上清匀浆液。严格按照钙离子浓度比色法定量检测试剂盒试剂说明书操作，采用比色法定量检测其颏舌肌组织中钙离子含量。准备5个1.5 mL的离心管，用缓冲液及标准液分别配制好0、0.5、1、2、4 mmol标准钙浓度，用以绘制标准曲线。取出比色杯，加入20 μL的缓冲液与20 μL的反应液，然后加入20 μL的标准液或待测匀浆液，混匀后，室温避光温育5 min，于570 nm波长检测其OD值。根据标准曲线计算出样本中钙离子含量。

结 果

“调宗气”组方对慢性间歇性低氧老年大鼠颏舌肌钙离子浓度的影响：实验结果表明，老年鼠对照组动物与青年鼠对照组比较，颏舌肌钙离子浓度极显著性降低(P＜0.001)，证明随着年龄的增长，颏舌肌逐渐松弛无力，与其中钙离子浓度降低有关。老年鼠模型组动物与老年鼠对照组比较，颏舌肌钙离子浓度极显著性降低(P＜0.001)，证明间歇性缺氧会造成动物颏舌肌中钙离子降低，导致颏舌肌松弛，模型复制成功。

中药组动物颏舌肌钙离子浓度与老年鼠模型组比较显著性增加(P＜0.05)，中药+运动组动物颏舌肌钙离子浓度与老年鼠模型组比较极显著性增加(P＜0.01)，中药+运动+吸氧组动物颏舌肌钙离子浓度与老年鼠模型组比较极显著性增加(P＜0.001)，证明中药、运动、吸氧对间歇性低氧模型动物颏舌肌钙离子浓度均有改善作用，并以联合应用的效果最为明显，见表1。

表1 “调宗气”组方对慢性间歇性低氧老年大鼠颏舌肌钙离子浓度的影响(±s)

表1 “调宗气”组方对慢性间歇性低氧老年大鼠颏舌肌钙离子浓度的影响(±s)

注：与老年鼠模型组比较，⋆P＜0.05， ⋆⋆P＜0.01，⋆⋆⋆P＜0.001。

讨 论

目前已证实许多危险因素参与OSAHS的发病和进展，其中以颏舌肌为主的上气道扩张肌结构和功能障碍被认为是OSAHS的主要致病因素之一。扩张肌中的颏舌肌是上气道中最大也是最主要的扩张肌，被称为上气道的“安全肌”。清醒状态下，OSAHS患者颏舌肌的活动达到其最大活动能力的40%，远较正常人12%的水平高，提示为了维持上气道开放，其上气道肌肉活动代偿性增强[8]。可以假设，如果没有代偿性活动，清醒时即有可能出现上气道阻力明显增高，甚至发生呼吸暂停。在睡眠时，阻塞性睡眠呼吸暂停患者上气道肌肉活动变化明显不同于正常人，睡眠开始，可见颏舌肌的吸气时相性活动减弱，其他扩张肌张力性活动也降低，对吸气负压增加的反射性代偿活动消失，不能对抗胸腹部呼吸肌产生的吸气负压而发生OSAHS[9-13]。Pierce等的研究发现OSAHS患者上气道陷闭以及气流阻力的增加与颏舌肌功能障碍密切相关[14]。

胞质内钙离子浓度直接影响骨骼肌收缩和松弛，进而引起咽部肌肉组织形态结构的改变，导致阻塞程度的加重或减轻。人体的多种运动都是由骨骼肌的收缩功能实现的，骨骼肌细胞的兴奋-收缩耦联机制是骨骼肌收缩的基础。胞质钙离子作为细胞内广泛的第二信使，在肌细胞的兴奋-收缩耦联过程中发挥重要作用。

本课题研究结果表明了“调宗气”组方对大鼠颏舌肌成肌细胞胞质内钙离子浓度有着显著的影响，在维持细胞内钙离子稳态过程中发挥重要作用，其维持肌细胞活性，从而减少肌肉的疲劳松弛与损伤。

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