Vero细胞微载体悬浮培养生产工艺研究

王景庆 游松 张微

（沈阳药科大学 辽宁 沈阳 110016）

动物细胞的体外培养已经广泛应用于药品特别是疫苗的生产中，通过生物反应器对Vero细胞和病毒进行大规模、高密度培养，并通过此方式进一步生产狂犬、乙脑等疫苗在国内已经为主流技术[1]。Vero细胞是一种典型的贴壁依赖性动物细胞，其生长、扩增繁殖需要有足够大的表面积，球状微载体悬浮培养这一技术平台很好的解决了以上的限制因素。因为很多种类的病毒（如狂犬病毒等）都是通过细胞表面吸附这一途径，进入到细胞中，然后利用细胞中的有效物质来繁殖。所以Vero细胞的大规模、高密度培养是生产过程中相当关键的一个步骤。本文重点是通过优化并更加合理的设置生物反应器的运行参数，以达到更良好的生产条件。

表1 细胞培养情况表

表2 细胞培养情况表

1.材料与方法

1.1 主要材料

138-143代Vero细胞（美国ATCC），M199和DME培养基，细胞培养时加5% 新生牛血清，微载体为Cytodex1[2，3]。

1.2 主要仪器

生物反应器为美国EPPENDORF公司CelliGen510型生物反应器（40L），倒置显微镜。

1.3 实验方法

1.3.1 Vero细胞的复苏准备：取第138代细胞，37℃乙醇浴融化；接种细胞到含有10%牛血清培养液的细胞瓶中，37℃培养；6～24小时后更换10%牛血清培养液；细胞代次为139代。

1.3.2 细胞培养：37℃、10%牛血清培养液培养，三次扩增达到可以进行生物反应器培养的细胞数量。

1.3.3 微载体的准备：按照15～20g/L生物反应器体积的比例称量微载体，用PBS溶液浸泡并121℃湿热灭菌60分钟；灭菌后的微载体用培养液进行平衡，室温浸泡72小时后使用。

1.3.4 生物反应器的准备：正确安装培养液流加管、搅拌浆、沉降柱等配件；向生物反应器内加入注射用水，密封生物反应器并检测气密性。气密性合格后在位湿热灭菌121℃40分钟；校正DO电极。

1.3.5 生物反应器细胞接种：观察转瓶内第142代细胞生长状态，汇合率达到100%时用0.25%胰酶消化上述细胞，制成细胞悬液；收集的细胞悬液混合于微载体容器中，再无菌连接到生物反应器，正压将细胞接种到生物反应器内。

1.3.6 生物反应器内细胞培养与正常生产的参数设置：40L反应器设定参数：温度37℃、转数38rpm、溶氧值（DO）15、pH值7.4、通气量0.1～8.0。

2.结果

2.1 生物反应器不同转数的持续培养对Vero细胞生长的影响，见表1。

2.2 生物反应器非正常转数对Vero细胞生长的影响，见表2。

3.讨论

微载体悬浮培养Vero细胞的生产工艺已应用到很多疫苗生产企业，这个技术平台通过微载体对动物细胞进行高密度的培养可以达到很好的规模效应。本次实验所用的是美国EPPENDORF公司生产的CelliGen510 型生物反应器，其是最新一代的生物反应器动物细胞培养平台，以往生产的生物反应器体积多为5L、7.5L、30L，本次实验所用CelliGen510 型生物反应器体积更大（40L），所以有着更好的经济效益。

通过生物反应器进行对Vero细胞和病毒进行大规模、高密度培养并通过此方式进一步生产相关疫苗，这一工艺虽然已应用到生产中去，但其整个工艺过程时间比较长（狂犬疫苗生物反应器连续运行过程达到20天，出血热疫苗等品种更长），设备出现异常的概率相对较高。特别是生物反应器的搅拌系统，长时间的工作容易出现转速波动等情况。高转数的发生会提高系统的剪切力从而导致细胞损伤（动物细胞易受剪切力损伤），而低转数会引起微载体沉积并使细胞无法生长，但细胞本身也有一定的耐受力，转数在一定范围内波动所引起的微小伤害可以恢复，且对细胞培养过程没有太大的影响。通过数据可知，一定范围内的转数对细胞影响不是很大，但超过一定区间会有影响。短时间内的转数波动在一定范围内细胞有一定的耐受力，但超过一定的范围会对细胞产生不可逆转的伤害。

本次实验中考察了生产过程中的转速波动对微载体悬浮培养Vero细胞的影响，对于提高生产效率有十分重要的借鉴作用。

[1]查力，高军，侯剑英，白珠穆，袁德明，杨俊伟，等.生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗中国生物制品学杂志，2006,19(3):288-290.

[2]CytidexTM 1: B eaded m icrocarriers for cell cu ltu re, Pharm acia FineChem icals, Technical Book let Seriw s,Uppsala, Sw eden 1978.

[3]VanW ezelAL. M icricarrier cu ltu res of an im al cells.In:K ruse PF,PatterssonMK, ed s. Tissu e cu ltu re: metbods and app lications. NewYork: A cadem ic Press,1973.372-377.