氨氯地平减轻腹主动脉缩窄性高血压大鼠心肌内质网应激

刘 静，赵连友，李 雪，郭 丽，张志敏，丁 璐，李晓莉

(第四军医大学唐都医院 心血管内科， 陕西 西安 710038)

研究论文

氨氯地平减轻腹主动脉缩窄性高血压大鼠心肌内质网应激

刘 静*，赵连友，李 雪，郭 丽，张志敏，丁 璐，李晓莉

(第四军医大学唐都医院 心血管内科， 陕西 西安 710038)

目的观察高血压大鼠心肌组织葡萄糖调节蛋白94(GRP94)和CAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的表达，探讨氨氯地平与内质网应激高血压大鼠心室肥厚的关系。方法将SD大鼠随机分为假手术组、腹主动脉缩窄术(AAB)组和氨氯地平干预(AAB+Aml)组，每组40只。给予氨氯地平10 mg/(kg·d)。随机分为2、4和8周3个亚组，测定平均动脉压(MAP)；计算左心室质量/体质量(LVM/BW)；HE染色观察心肌细胞的形态；免疫组化及Western blot检测心肌组织GRP94和CHOP的表达。结果随着术后时间的延长，AAB组MAP逐渐升高，明显高于假手术组[2周(144±10)比(118±9)、4周(163±8)比(120±7)、8周(177±10)比(120±6)mmHg](P<0.05)；AAB组LVM/BW显著高于假手术组[2周(2.21±0.17)比(1.91±0.12)、4周(2.45±0.16)比(2.01±0.14)、8周 (2.68±0.15)比(2.05±0.09)mg/g](P<0.05)； AAB组心肌细胞较假手术组明显肥大；术后2周 AAB组心肌组织GRP94明显表达，4周达最高值，8周减低；AAB组GRP94表达量高于假手术组(P<0.05)；随术后时间的延长，CHOP蛋白含量逐渐增加，8周达最高值。使用氨氯地平后，AAB+Aml组较AAB组MAP降低[2 周(126±6)比(144±10)、4 周(125±8)比(163±8)、8 周(128±5)比(177±10)mmHg](P<0.05)；使用氨氯地平后，AAB+Aml组较AAB组LVM/BW降低[2周(2.21±0.17)比(1.94±0.15)、4周(2.45±0.16)比(2.13±0.08)、8周(2.68±0.15)比(2.18±0.10) mg/g](P<0.05)；使用氨氯地平后AAB+Aml组较AAB组心肌细胞肥大程度减低。AAB+Aml组心肌组织GRP94及CHOP表达量低于AAB组(P<0.05)。结论氨氯地平可能通过减弱高血压触发的内质网应激而保护心肌细胞及减弱心室肥厚。

氨氯地平；内质网应激；葡萄糖调节蛋白94；CAAT/增强子结合蛋白同源蛋白；心室肥厚

内质网具有折叠蛋白、维持钙稳态及合成脂质的功能。氧化应激、缺血性损伤、钙稳态失衡和未/误折叠蛋白大量聚集时都会引发内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[1]。葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein 94,GRP94)是ERS的分子伴侣，主要功能是与未折叠蛋白结合使蛋白不相互聚集，维持细胞稳态[2]；CAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CAAT/enhancer-binding protein homologous protein. CHOP)为ERS特异的转录因子，是由抗凋亡向促凋亡转换的重要信号分子[3]。多种心血管疾病的病理生理过程均有ERS的参与[4]，但是否参与高血压左心室肥厚，是哪些分子发挥作用尚不清楚。氨氯地平是新型钙拮抗剂，因降压平稳和副作用少，且对靶器官具有保护作用而被广泛应用于临床。但其保护靶器官的具体机制目前仍不清楚。本研究探讨大鼠高血压时心肌组织发生ERS的机制及氨氯地平减弱左室肥厚的分子机制，为氨氯地平的临床应用提供更充分的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级SD大鼠120只，雄性，鼠龄8～10周龄，体质量180～220 g(第四军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：2012- 0007)。氨氯地平(苏州东瑞制药有限公司)；兔抗大鼠GRP94抗体和兔抗大鼠CHOP抗体(Epitomics公司)；辣根过氧化物酶标记(HRP)的羊抗兔二抗(Santa Cruz公司)；

1.2 方法

1.2.1 实验分组及高血压模型的建立：将大鼠随机分为假手术组、腹主动脉缩窄术(AAB)组和氨氯地平干预(AAB+Aml)组，每组40只。分为2、4和8周3个亚组，每组随机选取6只进行后续测定。腹主动脉缩窄术高血压大鼠模型建立方法参考文献[5]。

1.2.2 大鼠平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)及左心室质量/体质量(left ventricular mass/body mass, LVM/BW)的测定：具体方法参考文献[6]。

1.2.3 HE染色及免疫组化染色检测心肌组织GRP94和CHOP的表达：具体实验方法参考文献[7]。

1.2.4 Western blot检测心肌组织GRP94和CHOP蛋白的表达：提取心肌组织总蛋白，测定蛋白含量。每孔道加入50 μg蛋白进行SDS-PACE电泳并将蛋白质转移到PVDF膜上。然后于50 g/L脱脂奶粉TBST下室温封闭2 h，分别加入1∶1 000兔抗大鼠GRP94和CHOP，4 ℃振摇孵育过夜。TBS洗膜10 min×3次，加入二抗(1∶6 000), 室温下振摇90 min并洗膜。然后加入ECL试剂发光，采用Image-Pro Plus 6.0软件进行数据分析，以靶蛋白IOD值/β肌动蛋白(β-actin) IAD值反映靶蛋白的相对水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 氨氯地平对大鼠血压的影响

与假手术组相比，各时间点AAB组血压明显升高(均P<0.05)。较AAB组相比，AAB+Aml组血压明显下降(均P<0.05)(表1)。

表1 不同时间各组大鼠的MAP

*P<0.05 compared with sham group；△P<0.05 compared with AAB group of 2 weeks；#P<0.05 compared with AAB group of 4 weeks；☆P<0.05 compared with AAB group.

2.2 氨氯地平对大鼠LVM/BW的影响

假手术组在2、4和8周3个时间点LVM/BW无明显差异。AAB组大鼠LVM/BW随着术后时间延长而增加(P<0.05)。与假手术组相比，AAB组LVM/BW升高(均P<0.05)。与AAB组相比，AAB+Aml组LVM/BW下降(P<0.05)(表2)。

表2 不同时间各组大鼠的LVM/BW

*P<0.05 compared with sham group；△P<0.05 compared with AAB group of 2 weeks；#P<0.05 compared with AAB group of 4 weeks；☆P<0.05 compared with AAB group.

2.3 各组大鼠心肌细胞形态的变化

与假手术组相比，AAB组心肌细胞肥大程度明显增强。与AAB组相比，AAB+Aml组心肌细胞肥大程度明显减小(图1)。

2.4 大鼠心肌细胞GRP94的定性表达

AAB组大鼠心肌GRP94的表达主要定位于心肌细胞胞质中，染色呈棕黄色，术后2周时表达微量，4周时增强，8周时减弱。与假手术组比较，AAB组心肌细胞中棕黄色颗粒即GRP94表达明显；与AAB组比较，AAB+Aml组心肌细胞中棕黄色颗粒即GRP94表达不明显(图2)。

2.5 大鼠心肌细胞CHOP的定性表达

AAB组大鼠心肌CHOP的表达主要定位于心肌细胞胞质中，染色呈棕黄色，AAB组术后2周时表达微量，4周时增强，8周时最强。AAB组心肌细胞中棕黄色颗粒即CHOP表达较假手术组明显；AAB+Aml组心肌细胞中棕黄色颗粒即CHOP表达较AAB组不明显(图3)。

2.6 大鼠心肌细胞GRP94及CHOP的定量表达

假手术组大鼠3个时间点心肌组织GRP94无明显变化。AAB组大鼠心肌组织GRP94蛋白2周表达明显，4周表达最强，8周表达有所减弱，4周时，AAB组GRP94蛋白表达水平较假手术组和AAB+Aml组明显升高(P<0.05)(图4)。

假手术组大鼠3个时间点心肌组织CHOP无明显意义。AAB组CHOP蛋白表达呈逐渐增加，8周最强。4周和8周时， AAB组CHOP蛋白表达水平较假手术组和AAB+Aml组升高(P<0.05)。AAB+Aml组CHOP蛋白表达呈逐渐增加趋势，8周最强。

图1 大鼠心肌细胞HE染色结果Fig 1 HE staining results of rats myocardial cell(×200)

3 讨论

腹主动脉缩窄致高血压可引起血管平滑肌细胞(VSMCS)ERS反应，导致内质网相关因子钙网蛋白表达增加及caspase- 12的活化增高；拉西地平通过下调ERS水平，逆转高血压所致的VSMCS的损伤作用，对VSMCS具有保护作用[5]。本研究通过大鼠腹主动脉缩窄术建立了高血压模型。

*P<0.05 compared with sham group； △P<0.05 compared with AAB group of 2 weeks

腹主动脉缩窄后，大鼠血压及LVM/BW较假手术组升高，心肌细胞较假手术组明显肥大，说明发生了高血压左心室肥厚，模型建立成功。给予大鼠钙拮抗剂氨氯地平干预后，大鼠血压、LVM/BW较AAB组降低，心肌细胞肥大程度较AAB组明显减轻，说明氨氯地平减轻心肌细胞受损。

GRP94是ERS分子伴侣，主要于ERS早期表达，加快蛋白折叠，促进细胞存活，其表达量在一定程度上反映了ERS的强度[8]。有报道在主动脉弓缩窄术的高血压小鼠模型，1周后发现小鼠心肌组织中GRP94、GRP78、p-PERK及p-ERK等ERS信号分子表达较假手术组明显增加[9]。本实验观察到，腹主动脉缩窄术后2周，GRP94就有一定表达，4周时达最大值，之后减少。说明GRP94主要于心肌肥厚早期高表达，提示其可能发挥了保护心肌细胞的作用。氨氯地平明显减少GRP94表达量，提示氨氯地平可能在高血压触发的ERS早期通过降低ERS反应强度减弱了心室肥厚。

CHOP是ERS标志性凋亡分子，于ERS后期表达增强，加快细胞凋亡[10]。腹主动脉缩窄可使p38α未缺失的小鼠心肌中CHOP强表达，而p38α缺失的小鼠心肌中CHOP则未表达[11]。有报道随着模型大鼠血压的不断升高可诱导以CHOP蛋白为代表的凋亡因子在心肌中超表达，诱导细胞凋亡[12]。本实验观察到，腹主动脉缩窄2周，CHOP有弱表达，4周时稍强，8周时最强。提示CHOP可能与高血压后期左心室肥厚有关，激活下游凋亡通路，加速心肌细胞凋亡。氨氯地平后明显减少CHOP表达量，提示氨氯地平可能在高血压触发的ERS后期可通过降低ERS反应强度减弱了心室肥厚。

综上所述，在高血压大鼠模型心肌组织中，ERS信号分子GRP94和CHOP表达增加，提示高血压触发的ERS可能与高血压引起的心室肥厚有关；而氨氯地平可能通过降低ERS反应强度影响了心室肥厚。但是否还有其他信号分子参与有待进一步研究。

国内外已有结论:腹主动脉缩窄致可引起大鼠血压升高、心肌细胞形态改变并导致心室肥厚。ERS在多种心血管疾病的发生发展中起重要作用。氨氯地平是新型钙拮抗剂，因降压平稳副作用少且对靶器官具有保护作用而被广泛应用于临床。

本文的特色与见解：高血压大鼠模型心肌组织中，ERS信号分子GRP94和CHOP表达增加，提示高血压触发的ERS可能与高血压引起的心室肥厚有关；而氨氯地平可能通过降低GRP94及CHOP表达减弱了ERS，从而减弱了心室肥厚。

[1] Cominacini L, Mozzini C, Garbin U,etal. Endoplasmic reticulum stress and Nrf2 signaling in cardiovascular diseases[J]. Free Radic Biol Med, 2015, 88: 233- 242.

[2] Glembotski CC. The role of the unfolded protein response in the heart[J]. J Mol Cell Cardiol, 2008, 44: 453- 459.

[3] Oakes SA1, Papa FR.The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology.[J]Annu Rev Pathol， 2015,10:173- 194.

[4] 春玉虎, 党宏伟, 闫业军. 内质网应激在心血管疾病中的作用[J]. 临床心血管病杂志, 2015, 31: 1018- 1022.

[5] 李炜，赵连友，槐勇,等. 拉西地平对高血压大鼠血管平滑肌细胞CRT和caspase- 12表达变化的影响[J].中国循证心血管医学杂志，2012,6:250- 257.

[6] 胡中伟，赵连友，刘沙沙,等.噪声应激对大鼠心肌葡萄糖调节蛋白78和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白表达的影响与高血压及心肌重构的关系 [J].中华高血压杂志,2011,9: 836- 841.

[7] 耿兴华，李建东，刘圣君.促红细胞生成素对横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤时内质网应激相关蛋白的影响 [J]. 基础医学与临床, 2016. 36: 1268- 1273.

[8] Mclaughlin M, Vandenbroeck K. The endoplasmic reticulum protein folding factory and its chaperones: new targets for drug discovery?[J]. Br J Pharmacol, 2011, 162: 328- 345.

[9] Park CS, Cha H, Kwon EJ,etal. The chemical chaper-one 4-phenylbutyric acid attenuates pressure-overload cardiac hypertrophy by alleviating endoplasmic reticulum stress[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 421: 578- 584.

[10] 项荣, 严经纬, 范亮亮，等. 动脉粥样硬化中炎性反应与内质网应激的相互作用[J]. 基础医学与临床, 2014, 34: 253- 256.

[11] Sari FR, Widyantoro B, Thandavarayan RA,etal. Attenuation of CHOP-mediated myocardial apoptosis in pressure-overloaded dominant negative p38alpha mitogen-activated protein kinase mice[J]. Cell Physiol Biochem, 2011, 27: 487- 496.

[12] 张志敏，赵连友，卢凡,等.高同型半胱氨酸对高血压大鼠心肌细胞GRP78和CHOP表达及左室肥厚的影响[J]. 中国循证心血管医学杂, 2014，2: 223- 226.

Amlodipine decreases myocardial endoplasmic reticulum stress in rats with abdominal aortic banding hypertension

LIU Jing*, ZHAO Lian-you, LI Xue, GUO Li, ZHANG Zhi-min, DING Lu, LI Xiao-li

(Dept. of Cardiology, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710038,China)

ObjectiveTo study the expression of protein 94 (GRP94) and C/EBP-homologous protein (CHOP) in myocardial tissue of hypertensive rats and to investigate the effects of amlodipine on endoplasm retieulum stress(ERS) and ventricular hypertrophy in abdominal aortic banded rats.MethodsOne hundred and twenty adult male SD rats with criteria were divided randomly into three groups：sham-operated group, abdominal aortic banding(AAB) and AAB treated with amlodipine (AAB+Aml)groups(n=40). In sham-operated rats, the abdominal aorta was isolated but not constricted, while the abdominal aorta were constricted in AAB rats. The AAB+Aml group was treated by abdominal aortic constriction and treated with amlodipine [10 mg/(kg·d)]. According to the time of surgery，each group was further divided into 2, 4 and 8-week postoperative subgroups (n=6). Mean arterial pressure (MAP), the 1eft ventricular mass (LVM) and body mass (BM) were measured and (LVM/BM) was calculated. The morphology of cardiomyocytes was observed by HE staining. The protein level of GRP94 and CHOP was analyzed by immunohistochemistry and western blot.Results1)With time after surgery, MAP and LVM/BW of AAB group increased gradually, and they were obviously higher than the sham operation group[MAP: 2 weeks (144 ± 10)vs(118 ± 9), 4 weeks (163±8)vs(120±7), 8 weeks(177±10)vs(120±6)mmHg; LVW/BW: 2 weeks (2.21±0.17)vs(1.91±0.12), 4 weeks (2.45±0.16)vs(2.01±0.14), 8 weeks (2.68±0.15)vs(2.05±0.09)mmHg；(P<0.05)].The cardiomyocytes in AAB group were hypertrophic as compared to the sham group. The expression of GRP94 in AAB group increased significantly at 2 weeks post-operation, and reached peak level at 4 weeks after the surgery and was on the decline thereafter. The expression of CHOP and GRP94 in AAB rats were significantly higher than sham group, and reached the peak at the 8 weeks after surgery. 2)Treatment with amlodipine significantly reduced MAP and LVM/BW in AAB rats[(MAP: 2 weeks (126±6)vs(144±10), 4 weeks (125±8)vs(163±8), 8 weeks (128±5)vs(177±10)mmHg；LVM/BW: 2 weeks (1.94±0.15)vs(2.21±0.17), 4 weeks (2.13±0.08)vs(2.45±0.16), 8 weeks (2.18±0.10)vs(2.68±0.15)mg/g; (P<0.05)].The myocardial hypertrophic was alleviated in AAB+Aml group. The level of GRP94 and CHOP in AAB+Aml group was lower than those in AAB rats(allP<0.05).ConclusionsEndoplasmic reticulum stress is involved in the ventricular remodeling caused by hypertension, and use of amlodipine can reduce ventricular hypertrophy in hypertension models possibly by inhibiting endoplasmic reticulum stress via down-regulation of GRP94 and CHOP.

amlodipine；endoplasmic reticulum stress；glucose-regulated protein 94; CAAT/enhancer-binding protein homologous protein; ventricular hypertrophy

2016- 11- 29

2017- 03- 28

*通信作者(correspondingauthor)：liujing1314aiwojia@163.com

1001-6325(2018)01-0080-07

R544.1

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