双边栝楼成熟果实不同部位游离氨基酸及核苷类资源性化学成分分析与评价△

张黄琴，刘培，朱振华，董玲，李卫文，钱大玮，段金廒*

(1.南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/国家中医药管理局中药资源循环利用重点研究室/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023；2.安徽省农业科学院 园艺研究所，安徽 合肥 230031)

·专题·

双边栝楼成熟果实不同部位游离氨基酸及核苷类资源性化学成分分析与评价△

张黄琴1，刘培1，朱振华1，董玲2，李卫文2，钱大玮1，段金廒2*

(1.南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/国家中医药管理局中药资源循环利用重点研究室/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023；2.安徽省农业科学院 园艺研究所，安徽 合肥 230031)

目的通过对双边栝楼果实各部位(皮、瓤、种子)中核苷类、氨基酸类化学成分的分析评价，为其资源化利用提供科学依据。方法采用UPLC-MS/MS方法分析安徽产双边栝楼果皮、果瓤和种子中的氨基酸类、核苷类化学组成及含量。结果从双边栝楼果实各部位中检测到氨基酸19种，所测得氨基酸类成分含量为栝楼果皮(3.23%)>栝楼瓤(2.22%)>栝楼子(0.591%)，果瓤中精氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、脯氨酸约占所测得氨基酸总量的62%，果皮中瓜氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺约占所测得氨基酸总量的81%；种子中除精氨酸含量较高外，其他氨基酸含量均低于0.1%。各部位中胸苷和胞苷总量为栝楼果皮(116.9 μg·g-1)>栝楼瓤(38.09 μg·g-1)>栝楼子(23.38 μg·g-1)。结论双边栝楼果实各部位均含有较为丰富的游离氨基酸和核苷类化学成分，具有潜在的药用和营养保健价值；尤其是作为产地初加工废弃物的果瓤，值得深入开发利用。

双边栝楼；果实；化学成分分析；资源化利用评价

葫芦科植物双边栝楼TrichosanthesrosthorniiHarms是中药瓜蒌、瓜蒌皮和瓜蒌子的基原植物之一，全国广泛分布[1]。栝楼最早用药部位是根、果实，以根为主，到南北朝时，果实又分为果实、果皮、种子分别入药。《本草纲目》中记载：“敩曰，凡使皮子茎根其效各别”。果实(瓜蒌)具有清热涤痰、宽胸散结、润燥滑肠功能；果皮(瓜蒌皮)具有清热化痰、利气宽胸功能；种子(瓜蒌仁)具有润肺化痰、滑肠通便功能[2]。栝楼果实在《本草纲目》记载“实，止消渴”；《名医别录》记载“实，主胸痹，悦泽人面”。栝楼子单用入药最早见于《本草经集注》，主治痰热咳嗽，燥结便秘，痈肿，乳少；《雷公炮制药性赋》记载“仁，润肺下气止，痰嗽，疗乳痈乳闭”；栝楼子炒用，可去手面皱、悦泽人面。栝楼果皮单用入药最早记载于《雷公炮制论》，主治痰热咳嗽，咽痛，胸痛，吐血，衄血，消渴，便秘，痈疮肿毒。《普济方》记载栝楼瓤有美白治皲裂的功效：“栝楼瓤三两，杏仁一两，猪胰一具，同研如膏。每夜涂之，令人光润，冬月不皴”；《圣惠方》记载栝楼瓤可治消渴烦乱；《救荒本草》记载了栝楼瓤的食用价值：“采栝楼瓤，煮粥食，极甘”[3-6]。现代研究表明栝楼籽油与芝麻油、玉米油相比，具有更好的羟自由基去除效果，可作为理想的保健性食用油[7]；另外炒栝楼子(即吊瓜子)发展成为休闲食品深受大众喜爱。

近年来全国范围的栝楼种植面积有3万多公顷，主要集中在安徽、河南等地，安徽地区种植的品种主要为双边栝楼，以收集栝楼子、生产吊瓜子产生经济效益，附带收集少量瓜蒌皮和天花粉。双边栝楼全果的果皮、种子和果瓤质量比为1∶1∶1(干重)，在产地剖瓜取子的过程中，大量的果瓤废弃在田埂、河道，造成了极大的环境污染及资源浪费[8-9]。本文对安徽产双边栝楼各部位(果皮、种子、果瓤)中的游离氨基酸类和核苷类成分进行分析评价，以期为双边栝楼新资源的开发利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters ACQUITY UPLC系统(包括四元泵溶剂系统，在线脱气机和自动进样器，Waters公司，USA)；Xevo TQ检测器(Waters公司)；MassLynxTM质谱工作站软件(Waters公司)；电子天平(型号：ML204/02、MS-205，上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；Millipore Q纯水系统(美国Millipore公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；Anke GL-16GII离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试剂

乙腈(色谱纯，德国Merck)、甲酸(色谱纯，德国Merck)；甲酸铵(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)，乙酸铵(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；超纯水(实验室自制)。

胸苷(thymidine)(1)、亮氨酸(leucine)(2)、苯丙氨酸(phenylalanine)(3)、-氨基丁酸(-aminobutyric acid)(4)、色氨酸(tryptophan)(5)、异亮氨酸(isoleucine)(6)、甲硫氨酸(methionine)(7)、缬氨酸(valine)(8)、胞苷(cytidine)(9)、脯氨酸(proline)(10)、丙氨酸(alanine)(11)、羟脯氨酸(hydroxyproline)(12)、苏氨酸(threonine)(13)、谷氨酸(glutaminc acid)(14)、天冬氨酸(aspartic acid)(15)、谷氨酰胺(glutamine)(16)、赖氨酸(lysine)(17)、丝氨酸(serine)(18)、天冬酰胺(asparagine)(19)、瓜氨酸(citrulline)(20)、精氨酸(arginine)(21)均购自Sigma公司。高效液相色谱法测定化合物纯度均大于98%。

1.3 材料及处理

实验用双边栝楼果实3批(批号：GL2016120601～GL2016120603)采自安徽省合肥市长丰县安徽省农科院瓜蒌品种选育与示范基地(皖蒌7号)，经安徽省农业科学院园艺研究所董玲研究员鉴定为双边栝楼TrichosanthesrosthorniiHarms的果实，采集于2016年12月间。每批次分别取果皮、种子、果瓤3个部位，50 ℃鼓风干燥后，粉碎过筛，置干燥器中备用。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

分别取果瓤、种子、果皮各1 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密量取纯水20 mL，称重，静置1 h后，室温超声(40 kHz)提取60 min，称重，加水补足失量，摇匀，过滤，取滤液13 000 r·min-1离心10 min，取上清液，提取两次，合并上清液，经0.22 μm滤膜滤过后，即为供试品溶液。

2.2 对照品溶液制备

称取干燥至恒重的对照品适量，精密称定，甲醇-水(9∶1，V/V)定容，配制成化合物1～21质量浓度分别为10.20、100.5、102.5、100.5、26.62、52.75、10.90、101.5、10.35、106.0、104.5、105.5、102.0、104.0、106.5、103.5、105.0、105.5、102.0、107.5、104.5 μg·mL-1的混合对照品贮备液。不同浓度的混合对照品溶液由上述储备液经甲醇-水(9∶1，V/V)稀释得到。

2.3 色谱及质谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)。流动相：A-(5 mmol·L-1甲酸铵、乙酸铵、0.2%甲酸水溶液)B-(1 mmol·L-1甲酸铵、乙酸铵、0.2%甲酸乙腈溶液)，梯度洗脱(1～3 min，10% A；3～9 min，10%～18% A；9～15 min，18%～20% A；15～16 min，20%～46% A)，进样体积：2 μL，流速：0.4 mL·min-1，柱温：35 ℃。

离子化模式：ESI+/ ESI-；检测方式：多反应监测(MRM)，毛细管电压为3.0 kV，离子源温度为120 ℃；脱溶剂气流量和温度为1000 L·h-1和550 ℃，碰撞、锥孔气流量分别为0.15 mL·min-1、20 L·h-1，取样锥孔电压：4 V；碰撞能量：18 eV。典型样品色谱图见图1。

注：A.对照品；B.供试品；1.胸苷；2.亮氨酸；3.苯丙氨酸；4.γ-氨基丁酸；5.色氨酸；6.异亮氨酸；7.甲硫氨酸；8.缬氨酸；9.胞苷；10.脯氨酸；11.丙氨酸；12.羟脯氨酸；13.苏氨酸；14.谷氨酸；15.天冬氨酸；16.谷氨酰胺；17.赖氨酸；18.丝氨酸；19.天冬酰胺；20.瓜氨酸；21.精氨酸。图1 氨基酸类和核苷类UPLC-MS/MS色谱图

2.4 样品含量测定结果分析

双边栝楼成熟果实不同部位游离氨基酸、核苷类成分测定结果见图2。栝楼果皮、种子、果瓤3个部位中所测氨基酸总量分别为32.3、5.91、22.2 mg·g-1，果皮中所测氨基酸总量高于种子和果瓤。栝楼果皮、种子、果瓤中所含人体必需氨基酸总量分别为6.29、0.658、2.77 mg·g-1；精氨酸在种子和果瓤中较其他氨基酸含量均最高，分别为3.31、6.45 mg·g-1；瓜氨酸在果皮中含量较其他氨基酸含量较高,达9.51 mg·g-1。栝楼果皮、种子、果瓤中均测得胸苷、胞苷两个核苷类成分，胸苷与胞苷在果皮中的含量均高于种子、果瓤，3个部位中腺嘌呤、腺苷含量低于检测下限。

图2 栝楼果实不同部位中氨基酸类、核苷类成分柱状图

3 讨论

通过对本实验检测方法的精密度、重复性、稳定性、线性以及加样回收率进行方法学考察，证明该检测方法符合定量测定的要求，可以用来检测各类成分。

从双边栝楼果实各部位中检测到氨基酸19种，果皮中总氨基酸和核苷的含量最高，果瓤次之，种子含量较低。果瓤中精氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、脯氨酸4种氨基酸类成分约占所测氨基酸量的62%，而果皮中含量较高的氨基酸类成分有：瓜氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺，四者总量约占所测氨基酸总量的81%；种子中除精氨酸含量较高外，其他氨基酸含量均低于0.1%。

双边栝楼果实各部位中均含有一定量的精氨酸，精氨酸在DNA、RNA及蛋白质的生物代谢、细胞生长周期、T细胞免疫反应以及中枢神经系统原发性免疫反应中起到关键作用[10]。精氨酸是人体内合成一氧化氮的前体物，一氧化氮对于增强肺脏、肝脏、肾脏、胃肠等脏器功能有重要的作用[11]，也利于平衡血压、增强血流、改善心脑供血、增强血管弹性、恢复动脉硬化[12]。

瓜氨酸和丝氨酸在果皮和果瓤中含量也较高，瓜氨酸是生物体内赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶碱基的合成前体。瓜氨酸可以改善和保护心肌功能，促进尿素生成，降低血液中氮和二氧化碳含量，增强肝脏功能，消除疲劳[13-16]。丝氨酸在脂肪和脂肪酸的新陈代谢、肌肉的生长以及免疫系统中发挥着作用，在细胞膜的制造加工和包围神经细胞鞘的合成中也发挥作用[17-18]。

双边栝楼果实各部位中均含有胸苷、胞苷、腺嘌呤和腺苷等核苷类成分，但腺嘌呤和腺苷含量较低，未能定量。胸苷可作医药中间体，用于合成抗病毒和抗HIV药；胞苷可作药品合成原料和生化试剂，用于2′，3′-二去氧胞苷、阿糖胞苷等的制备。

双边栝楼果实产地初加工废弃物(果瓤)丰富，目前尚未得到充分利用，本研究结果为该类生物资源的有效利用提供了一定的参考，对提升双边栝楼的综合利用效率起到积极的推动作用。

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AnalysisandEvaluationofAminoAcidsandNucleosidesinDifferentPartsofRipeFruitofTrichosanthesrosthorniiHarms

ZHANGHuangqin1，LIUPei1，ZHUZhenhua1，DONGLing2，LIWeiwen2，QIANDawei1，DUANJin’ao1*

(1.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，StateAdministrationofTraditionalChineseMedicineKeyLaboratoryofChineseMedicinalResourcesRecyclingUtilization，NationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.InstituteofHorticulture，AnhuiAcademyofAgriculturalSciences，Hefei230031，China)

Objective：To provide the theoretical basis for the comprehensive utilization ofTrichosanthesrosthorniiHarms，nucleosides and amino acids in different parts ofT.rosthornii(peel，pulp and seed) were analyzed and evaluated.MethodsUltra performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC/MS-MS) technique was used to determine the contents of nucleosides and dissociative amino acids of different parts inT.rosthorniiplanted in Anhui.ResultsIn the samples ofT.rosthornii，19 kinds of amino acids were detected.The total amount of amino acids is sorted as fruit peel (3.23%) > fruit pulp (2.22%) > seed (0.591%).The main amino acids in fruit pulp are arginine，citrulline，serine，proline.The total amount of the four accounts for about 62% of the total amino acid content.Citrulline，arginine，lysine and glutamine were at a high levels in fruit peel.The total amount of the four accounted for about 81% of the total amino acid content.The content of arginine in the seeds was relatively higher，and the content of other amino acids was less than 0.1%.The total amount of thymidine and cytidine was sorted as fruit peel (116.9 μg·g-1) > fruit pulp (38.09 μg·g-1) > seed (23.38 μg·g-1).ConclusionThe different parts ofT.rosthornii(peel，pulp and seed) contain a number of dissociative amino acids and nucleosides，with potential medicinal and nutritional value.Especially，the pulp which is the waste in initial processing in origins is worth in-depth development and utilization.

TrichosanthesrosthorniiHarms，fruit，chemical composition analysis，resource utilization evaluation

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.005

江苏高校优势学科建设工程项目(PAPD)；江苏省“333高层次人才培养工程”项目；公益性行业科研专项(201407002)

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段金廒，教授，博士生导师，中国自然资源学会中药及天然药物资源研究专业委员会主任委员，中国中药协会中药资源循环利用专业委员会主任委员，研究方向：中药资源化学与资源循环利用；Tel：(025)85811291，E-mail：dja@njutcm.edu.cn

2017-11-10)