苹果病原真菌拮抗菌HMQAU140045的分离与鉴定

赵云福+邱东晓+梁晨+王佳宁

摘要：为开发苹果病原真菌生防菌剂，采用稀释分离法、生长速率法、平板对峙法等从土壤中筛选出对苹果腐烂病（Cytospora mandshurica）、轮纹病（Botryosphaeria dothidea）、斑点落叶病（Alternaria mali）具有明显拮抗作用的菌株，并根据其形态、生理生化特征、16S rDNA序列分析等进行鉴定。结果表明，菌株HMQAU140045抑菌效果显著，对3种苹果病原真菌菌丝生长和孢子萌发均有显著抑制作用，经其无菌发酵滤液处理后，病原菌菌丝畸形，分支增多，局部膨大，分生孢子不萌发或萌发产生的芽管畸形肿大成球状泡。鉴定结果表明该菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

关键词：苹果真菌病害；拮抗菌株；分离；鉴定；解淀粉芽孢杆菌

中图分类号：S476.19文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）12-0054-05

Abstract An antagonistic bacterium strain HMQAU140045 with strong inhibitory activity against three fungal pathogens from apple trees （e.g. Cytospora mandshurica， Botryosphaeria dothidea， and Alternaria mali） was isolated from soil by using dilution plate method， plate growth rate and flat confrontation culture method.The strain was identified as Bacillus amyloliquefaciens based on the 16S rDNA sequence homology， the physiological and biochemical characteristics and morphological observation. The strain had significant inhibitory effect on mycelial growth and spore germination of the three apple pathogenic fungi. After treated by HMQAU140045 fermentation filtrate， the mycelia were malformed， spores did not germinate or generated germ tubes swollen to form spherical bubbles.

Keywords Apple fungal diseases； Antagonistic bacteria strain； Isolation； Identification； Bacillus amyloliquefaciens

中國是世界上最大的苹果生产国和消费国，栽培面积和产量均居世界首位[1]。近年来，随着果树种植结构调整，病害发生程度日趋严重。目前已知苹果病害90余种，其中腐烂病、轮纹病、斑点落叶病、炭疽病等真菌性病害为各苹果产区最常见和严重病害[2，3]。

目前苹果真菌性病害的防治主要依赖化学农药，化学农药的频繁施用不仅易造成环境污染，病原菌抗性增加，而且成为威胁苹果质量安全的最主要风险因素，因此寻找安全可行的病害控制手段成为当前果业生产中亟待解决的问题。生物防治以其绿色、无污染、不易产生抗性等优点受到人们普遍关注，利用生防细菌来防治植物病害是生物防治的一种主要手段。张淑颖等[4]从剑麻叶片分离获得一株枯草芽孢杆菌，对离体枝条上苹果腐烂病菌的扩展有较好的抑制效果。马荣等[5]通过组织分离、平板对峙法筛选得到对苹果腐烂病菌拮抗效果达到87%的枯草芽孢杆菌。黄玲玲等[6]利用解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7发酵液、菌悬液及其无菌胞外抗菌蛋白对苹果轮纹病菌平板抑制和果体抑制效果分别进行了试验，指出其发酵液、菌悬液的抑菌作用更好。目前针对苹果拮抗微生物的研究已做了很多工作，但尚未见利用拮抗菌防治苹果园常见真菌性病害的报道。本文以苹果腐烂病、轮纹病、斑点落叶病等为靶标病害，通过广泛采样，筛选出拮抗谱较广的菌株，以期为生防菌剂开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

烟台、青岛、淄博等地苹果园、桃园、蓝莓园根际土壤。

1.2 供试菌株及培养基

苹果腐烂病菌（Cytospora mandshurica）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）、斑点落叶病菌（Alternaria mali）、炭疽病菌（Glomerella cingulata）等采自烟台栖霞、蓬莱苹果园，青岛农业大学真菌学研究室分离保存。

1.3 培养基

LB、PD、PDA培养基等[7]。

1.4 拮抗菌株的分离、筛选

采用稀释分离法对不同来源的土壤样品进行菌株分离，选取不同菌落进行划线纯化，编号、保存备用。采用对峙培养法[8]从细菌菌株中筛选对苹果腐烂病菌、轮纹病菌、斑点落叶病菌、炭疽病菌有拮抗作用的菌株，测量抑菌带宽度。试验数据采用SPSS 进行统计处理和邓肯氏新复极差检验。

1.5 拮抗菌株发酵滤液对苹果病原真菌的抑制作用试验

采用菌丝生长速率法测定拮抗菌株发酵液稀释50、100、150、200倍对苹果病原菌的抑制作用。种子液及发酵条件：将拮抗菌用接种环刮取接种到LB液体培养基中，30℃摇床振荡培养24 h得到种子液。培养好的种子液按1.5%的比例接种到发酵培养基中，配方为玉米粉2.0%、胰蛋白胨1.0%、酵母提取物1.0%、磷酸氢二钾0.5%、pH值6.5，培养温度28℃，180 r/min振荡培养80 h，经0.22 μm细菌过滤器过滤除菌。将发酵滤液滴于溶化的PDA培养基中，使其稀释不同倍数，凝固后，接种6 mm病原菌菌饼，4 d后显微镜下观察病原菌菌丝生长形态，并拍照，采用十字交叉法测量对照组直径和处理组直径，计算抑菌率[9]。用无菌水制备成浓度为 106个/mL 的孢子悬浮液备用。将拮抗菌发酵滤液按 50、100、150、200倍的稀释比例分别与不同病原菌孢子悬浮液混匀，各取25 μL 滴在载玻片中央，并置于装有1%水琼脂的培养皿中密封，25℃恒温保湿36 h 后观察孢子萌发情况，计算对孢子萌发抑制率，并拍照[10，11]。endprint

1.6 拮抗菌株的鉴定

拮抗菌株形态观察和生理生化特性分析参照《常见细菌系统鉴定手册》[12]。

用改良CTAB法提取拮抗菌株基因组DNA[13]。

拮抗菌株16S rDNA 的 PCR 扩增及序列分析：提取菌株基因组 DNA 后，利用细菌通用引物27-F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′）和 1492-R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）对拮抗菌株基因组 DNA 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系（25 μL）：2×PCR Master Mix 5 μL，27F/1492R（10 μmol/L）各 1 μL，模板 DNA 5 μL，补水至 25 μL。反应条件：94℃预变性 5 min；94℃变性 1 min，53℃复性 1 min，72℃延伸 1 min，30 个循环；72℃延伸 7 min。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程有限公司进行纯化及双向测序，测序结果与GenBank数据库中已知16S rDNA序列进行BLAST比对，利用MEGA 6.0构建系统发育树[14]。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的分离与筛选

从不同土壤样品中共分离得到细菌48株。通过对峙培养法从中筛选出对几种苹果病原真菌均具有明显拮抗作用的拮抗细菌3株，见表1。3株拮抗菌均对苹果腐烂病菌拮抗效果最好，抑菌带宽度均达9.4 mm及以上，且均对炭疽病菌拮抗效果稍差。综合比较，选取对各病原菌抑制效果相对较好的菌株HMQAU140045进行后续研究。

2.2 拮抗菌株发酵滤液对苹果病原真菌抑制作用

由表2可知，菌株HMQAU140045发酵滤液对苹果腐烂病菌的抑菌效果最好，稀释50～100倍对菌丝生长的抑制率均可达100%，随稀释倍数的增大对菌丝的抑制率逐渐下降，稀释200倍后抑制率仍达82.06%；对孢子萌发抑制率与对菌丝的表现相似，发酵液稀释200倍孢子萌发抑制率仍达92.74%。菌株发酵液对轮纹病菌和斑点落叶病菌的抑制作用表现类似腐烂病菌。菌株HMQAU140045各稀释倍数发酵液对3种病原菌的平板抑菌效果见图1。

图2镜检发现，未经处理的分生孢子萌发后芽管粗壮均匀，生长迅速；经发酵滤液处理的病原菌分生孢子及芽管明显畸形，孢子萌发芽管很短或分生孢子显著膨大畸形，芽管不能继续伸长。对照病原菌菌丝粗细均匀、分枝较少，经发酵液处理病原菌菌丝颜色明显加深，菌丝中间或顶端显著膨大，有的菌丝分支增多，甚至多条菌丝聚集融合在一起，部分菌丝细胞质外渗。

结果表明菌株HMQAU140045产生拮抗活性物质对苹果病原真菌菌丝生长和孢子萌发具有显著的抑制作用。

2.3 拮抗菌形态和生理生化鉴定

菌株HMQAU140045于LB固体培养基上30℃培养2 d，菌落直径0.5～2.5 mm，菌落凸起呈乳白色、不透明、圆形、边缘不规则、表面有褶皱，在菌落边缘有晶体状物质。菌体革兰氏染色阳性，杆状（0.93±0.24）～ （2.01±0.52） μm，单个或成对排列，产芽孢。该菌株既不好氧，也不厌氧，其糖醇类发酵、接触酶试验、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、V-P测定等为阳性反应，甲基红和反硝化反应为阴性，抗逆性表现较强，其它生理生化鉴定结果见表3。

2.4 菌株分子生物学鉴定

利用细菌通用引物27F/1492R对菌株HMQAU140045的16S rDNA片段进行PCR扩增，经测序分析，确定该片段全长1 492 bp。将扩增得到的序列与GenBank中BLAST数据库中的核酸序列进行同源性比较，构建系统进化树如图3。结果表明，菌株HMQAU140045与解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens（GenBank登录号为KP686229）的同源性达到99%，菌株HMQAU140045与4株Bacillus amyloliquefaciens菌株的序列位于系统发育树的同一分支。

综合形态学观察、生理生化特性和16S rDNA序列分析同源性比对数据和系统发育树位置，将菌株HMQAU140045鉴定为解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

3 讨论与结论

苹果生产中对常见真菌性病害以化学防治为主，施药频次高，对环境压力大，以斑点落叶病为例，周年防治次数7次以上，目前可用登记农药品种500个左右（截至2016年12月），而登记的活体微生物杀菌剂产品仍为空白。本研究筛选出的HMQAU140045对供试3种苹果病原真菌均有较强的抑菌活性，经菌落形态观察、生理生化鉴定以及16S rDNA 序列分析，最终确定菌株HMQAU140045为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），是一种与枯草芽孢杆菌具有很高亲缘性且具有广泛抑菌谱的细菌。陈士云等[15]从土壤中分离出解淀粉芽孢杆菌CH-2，发现其培养液经硫酸铵沉淀后能抑制油菜核盘菌菌丝的生长，还可抑制菌核的形成；陈成等[16]分离得到一株解淀粉芽孢杆菌，对黑曲霉、稻瘟病菌、水稻纹枯病菌等均有良好的抑制作用；陈蕾蕾等[17]发现一株广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌，菌体及发酵液具有拮抗桃根霉腐烂病、黄瓜枯萎病、枣炭疽病、梨黑斑病、苹果褐腐病等植物病原菌及拮抗金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌、酵母等食源性致病菌和腐败菌的作用，广谱抗菌并且效果稳定持久。

解淀粉芽孢杆菌在其生长过程中能够产生多种抑菌物质，具有广泛抑制真菌与细菌的功能，主要抑制分生孢子的萌发和菌丝生长，以及导致病原菌菌丝畸形，如顶端膨大、分支增多、细胞质外渗等[18-20]，这在本研究中也得到部分证实。近几年关于解淀粉芽孢杆菌抑菌机制的研究报道越来越多，有的研究已经深入到分子水平[21]。本研究筛选的解淀粉芽孢杆菌对苹果树几种真菌性病害拮抗活性较高，具有较好的开发和应用价值。endprint

参 考 文 献：

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