回肠转位术对2型糖尿病大鼠血糖及肠道屏障的影响及机制研究

蔡逊 王世杰 马丹丹 傅涛 刘勇 孙康

·论 著·(实验研究)

回肠转位术对2型糖尿病大鼠血糖及肠道屏障的影响及机制研究

蔡逊 王世杰 马丹丹 傅涛 刘勇 孙康

目的观察回肠转位术(ileal transposition, IT)对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptide-2, GLP-2)、D乳酸及二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)的影响，探讨IT对T2DM大鼠血糖和肠黏膜屏障的影响及相关机制。方法随机数字表法将60只T2DM大鼠分为IT组和假手术组(Sham组)，每组30只。观察并测定两组大鼠术前及术后3d、1周(w)、2w、4w、6w、8w FBG、GLP-1、GLP-2、D乳酸、DAO水平的变化。结果与术前比较，IT组T2DM大鼠术后3d FBG、GLP-1及GLP-2差异无统计学意义(P>0.05)，术后1w、2w、4w、6w、8w FBG明显下降(t1w=6.148,P1w<0.001 ;t2w=8.650,P2w<0.001 ;t4w=9.569,P4w<0.001;t6w=11.201,P6w<0.001;t8w=12.424,P8w<0.001)，GLP-1及GLP-2均显著升高[(GLP-1:t1w=-12.794,P1w<0.001;t2w=-18.477,P2w<0.001;t4w=-24.252,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001)、 (GLP-2:t1w=-12.305,P1w<0.001;t2w=-14.708,P2w<0.001;t4w=-28.142,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001)]。与术前相比，IT组术后3 d DAO及D-乳酸均较术前明显升高(DAO:t3d=-46.223,P3d<0.001；D-乳酸:t3d=-6.439,P3d<0.001)，但术后1w、2w、4w、6w、8w DAO及D-乳酸与术前比较，差异无统计学意义(P>0.05)。相同条件下，Sham组上述指标均未见明显变化(P>0.05)。结论IT通过刺激GLP-1和GLP-2分泌增加来发挥降低血糖和保护肠道屏障功能的作用。

回肠转位术； 2型糖尿病； 大鼠； 胰高血糖素样肽； 肠道屏障

胃肠道除消化、吸收、分泌功能及免疫调节外，还具有重要的屏障功能[1]。在正常情况下，人体肠黏膜能有效阻止肠道内细菌、毒素及有害物质侵入体内[2]。但在手术、创伤、休克、严重感染、脓毒症等应激情况下，胃肠道黏膜易受到攻击和损害而发生屏障功能障碍[3]。一般情况下，2型糖尿病(lype 2 diabetes mellitus, T2DM)大鼠在回肠转位术(ileal transposition, IT)这一手术应激情况下，胃肠道黏膜易受损而发生屏障功能障碍，但是国内外却未见相关报道。因此我们推测：IT可能通过其他方式保护T2DM大鼠的肠黏膜屏障功能。基于以上推测及本课题组前期研究的基础[4-5]，我们选择T2DM大鼠模型进行回肠转位术手术干预，旨在分析回肠转位术对大鼠的降糖效果作用，并通过分析手术前后胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)的变化，探讨其可能的机制，以期为IT进一步临床应用提供理论和实践依据。更为重要的是通过观察IT对胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptide-2, GLP-2)、D乳酸及二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)的影响，探讨IT对T2DM大鼠肠黏膜屏障的影响及机制。

材料与方法

一、实验动物的购买、饲养、模型建立及分组

SPF级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠60只，6周龄，体重180～200 g，购于武汉大学动物实验中心，室内通风良好，室温20 ℃～25 ℃，相对湿度40%～70%，每日光照12 h，自由摄食饮水。建模方法参考文献[6-7]报道：高脂高糖喂养4周(w)，腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ) 35 mg/kg。注射后3 d尾静脉测大鼠血糖，以空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)值≥16.7 mmol/L，并稳定10 d，为大鼠造模成功。T2DM大鼠模型随机分为2组，分别为：IT组和假手术组(Sham组)，每组30只大鼠以1～30随机编号。

二、手术分组及处理

两组糖尿病大鼠术前禁食不禁水12 h，均用10%水合氯醛按0.5 ml/100 g体重进行腹腔注射麻醉。仰卧位固定四肢及头部，用聚维酮碘(碘伏)常规消毒铺巾，于上腹部正中切口进腹，切口长3～4 cm。①IT组：自回盲部近端5～10 cm处截取约6～10 cm回肠段，保留小肠系膜，距屈氏韧带5～10 cm横断空肠，将所截取回肠段按原来的蠕动方向做两个端端吻合间置于横断的空肠中间。吻合完毕，生理盐水冲洗腹腔，逐层关腹。吻合肠管使用6-0的可吸收缝线连续缝合，吻合口前层和后层浆肌层包埋各两针，关腹使用4-0的丝线缝合。详见图1。②假手术组：仅行腹壁切开缝合术。

三、观测指标及方法

手术当天禁食禁水，术后第1天禁食不禁水，术后第2天恢复术前的饮食。测量术前及术后3d、1w、2w、4w、6w、8w回肠转位组和假手术组的FBG、GLP-1、GLP-2、DAO和D-乳酸水平。2组大鼠隔夜禁食12 h，断尾或眼球摘除取血1.0 ml，血糖仪检测FBG，静置离心，分离血清按照ELISA试剂盒说明书对GLP-1、GLP-2、DAO和D-乳酸数值进行检测。

A.上腹部正中切口进腹;B.截取约6cm回肠;C.端端吻合图1 回肠转位术

表1 不同时间两组大鼠FBG、GLP-1及GLP-2水平比较±s)

注：与术前比较，*P<0.001

四、统计学方法

结 果

一、两组大鼠的FBG、GLP-1及GLP-2水平比较

同组内与术前比较，IT组大鼠术后3d FBG、GLP-1及GLP-2差异无统计学意义(P>0.05)，术后1w、2w、4w、6w、8w FBG较术前显著下降(t1w=6.148,P1w<0.001;t2w=8.650,P2w<0.001;t4w=9.569,P4w<0.001;t6w=11.201,P6w<0.001;t8w=12.424,P8w<0.001)、GLP-1及GLP-2均显著升高(GLP-1:t1w=-12.794,P1w<0.001;t2w=-18.477,P2w<0.001;t4w=-24.252,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001；GLP-2:t1w=-12.305,P1w<0.001;t2w=-14.708,P2w<0.001;t4w=-28.142,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001)。见表1。

二、两组大鼠的血浆DAO及D-乳酸水平比较

术前2组大鼠空腹D-乳酸及DAO差异无统计学意义。与术前相比，IT组术后3 d DAO及D-乳酸均较术前明显升高(DAO:t=-46.223,P<0.001)、(D-乳酸:t=-6.439,P<0.001)，术后1w、2w、4w、6w、8wDAO及D-乳酸与术前比较，差异无统计学意义。相同条件下，Sham组却无此变化。见表2。

表2 不同时间两组大鼠DAO及D-乳酸水平比较±s)

注：与术前比较，*P<0.001

讨 论

Pories等[8]于1995年报道称胃转流术对T2DM病人的血糖具有显著的改善作用，且无需采取任何降糖措施维持，开创外科手术治疗T2DM的新途径。近年来，随着手术治疗糖尿病研究的不断深入，越来越多的新术式不断涌现，目前，国外学者通过对T2DM大鼠进行IT，取得了良好的降糖效果[9-10]。但该术式的有效性、安全性、性价比、应用前景和进一步的临床应用等仍需进一步研究论证。因此本研究旨在探讨IT对T2DM大鼠的降糖作用和对肠黏膜屏障的影响及相关机制。

IT术式操作简单，既不缩减消化道容量，也不改变消化道长度和胃肠道延续性，只是通过调整肠道排序来调节机体的生理代谢，几乎避免了其他减重代谢术式带来的各种并发症。被誉为是最符合代谢外科设计理念的手术方式[11]。IT可使未完全消化的食物提前进入回肠，食物持续不断刺激大鼠肠道L细胞分泌GLP-1和GLP-2。研究[12]认为肠-胰岛素轴中控制T2DM最核心的介导因子即是GLP-1。GLP-1由30个氨基酸组成，是一种末端空回肠L细胞分泌的肠肽激素。其主要的生理功能为减少食物吸收，抑制胃动力、胃酸分泌及胃排空，抑制胰高血糖素分泌，促进胰岛β细胞增生及胰岛素合成与分泌。本研究中，术后1w、2w、4w、6w、8w FBG较术前显著下降，GLP-1显著升高。结果表明：IT对T2DM大鼠有显著的降糖作用，其可能的机制是食物提前进入回肠，刺激GLP-1分泌增加，增加胰岛素分泌。与国内外研究结果相一致[13-14]。

哺乳动物的组织在正常情况下既不产生也不代谢D-乳酸，但在肠道应激(如手术、缺血、创伤、感染等)情况下，肠黏膜屏障通透性迅速增高，血中D-乳酸蓄积。故血浆D-乳酸作为肠黏膜屏障通透性的标志物，直接反映肠黏膜通透性和屏障功能的损害程度[15-16]。血浆DAO是人类和所有哺乳动物肠黏膜细胞胞质中具有高度活性的细胞内酶。当肠黏膜细胞受损坏死时，DAO即刻释放入血，导致血中活性增高。因此血DAO水平是监测肠黏膜损伤的较好指标[17]。本研究中，IT组术后3 d DAO及D-乳酸均较术前明显升高，术后1w、2w、4w、6w、8w DAO及D-乳酸与术前比较，差异无统计学意义。结果表明IT术后3d造成2型糖尿病大鼠肠黏膜受损而发生屏障功能障碍，但是随着时间的推移，肠道屏障功能得以恢复，具体机制不明。GLP-2属于胰高血糖素原衍生肽类，是一种由33个氨基酸组成的单链多肽，作用仅限于肠道，具有器官特异性。其主要由肠道L细胞合成、分泌，通过肾脏排泄。而肠道L细胞主要集中于回肠和结肠，其分泌受饮食、神经和内分泌等多种因素调节[18-19]。GLP-2主要功能有：增加肠道血供，促进肠黏膜生长，抑制肠上皮细胞凋亡，增加黏膜己糖的转运及消化酶的表达，进而降低肠道通透性，从而达到保护肠道屏障功能的作用[20-21]。本研究中IT组术后1～8w GLP-2较术前显著增加。由此可见回肠转位术使食物提前进入回肠，持续不断刺激GLP-2分泌，GLP-2表达增加可来保护肠道屏障功能。

综上所述，IT通过调控GLP-1和GLP-2的表达来发挥降低血糖和保护肠道屏障功能的作用。相信随着科研工作者不断深入地探讨和研究，IT进一步应用到临床，将使广大T2DM病人获益。

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Effectofilealtranspositionsurgeryonbloodglucoseandintestinalbarrierinratswithtype2diabetesmellitusandpossiblemechanism

CaiXun,WangShijie,MaDandan,FuTao,LiuYong,SunKang.

DepartmentofGeneralSurgery,WuhanGeneralHospitalofPeople'sLiberationArmy,Wuhan430070,China

FuTao,Email:surgfu@sina.com

ObjectiveTo observe the effect of ileal transposition(IT) surgery on fasting blood glucose(FBG), glucagon-like peptide-1(GLP-1), glucagon-like peptide-2(GLP-2), D lactate and diamine oxidase(DAO) expression, and intestinal barrier in type 2 diabetes mellitus(T2DM) rats and the possible mechanisms.MethodsT2DM rats were randomly divided into IT surgery group(n=30) and sham operation group(n=30). The FBG, GLP-1, GLP-2, D lactate and DAO levels in the two groups were determined before and 3 days, 1 week, 2 weeks, 4 weeks, 6 weeks, 8 weeks after operation.ResultsThere was no significant difference in FBG, GLP-1 and GLP-2 before and at 3rd day after operation in IT group(P>0.05). FBG levels were significantly decreased (t1w=6.148,P1w<0.001;t2w=8.650,P2w<0.001;t4w=9.569,P4w<0.001;t6w=11.201,P6w<0.001;t8w=12.424,P8w<0.001),and GLP-1 and GLP-2 levels were significantly increased at 1w, 2w, 4w, 6w, 8w in IT group[(GLP-1:t1w=-12.794,P1w<0.001;t2w=-18.477,P2w<0.001;t4w=-24.252,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001) and (GLP-2:t1w=-12.305,P1w<0.001;t2w=-14.708,P2w<0.001;t4w=-28.142,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001)]. As compared with preoperation, D lactate and DAO levels were significantly increased at 3rd day after operation in IT group[(DAO:t3d=-46.223,P3d<0.001); (D lactate:t3d=-6.439,P3d<0.001)]. There was no significant difference in D lactate and DAO levels before and at 1w, 2w, 4w, 6w, 8w after operation in IT group(P>0.05). Under the same conditions, there were no obvious changes in the above indexes in sham group(P>0.05).ConclusionsIT surgery has a significant hypoglycemic effect and can protect intestinal barrier function by stimulating the secretion of GLP-1 and GLP-2.

Ileal transposition; Type 2 diabetes mellitus; Rats; Glucagon-like peptidel; Intestinal barrier

R657.7; R587.1

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2017.06.019

湖北省卫生计生委科研项目(WJ2017H0048, WJ2017H0043)

430070 武汉，中国人民解放军武汉总医院普通外科(蔡逊、马丹丹、傅涛、刘勇、孙康)；南方医科大学中国人民解放军总医院(王世杰)

傅涛，Email：surgfu@sina.com

10.16151/j.1007-810x.2016.05. 001.

2017-06-12)