番茄红素对人骨肉瘤细胞生长的影响及机制研究

孟永生

番茄红素对人骨肉瘤细胞生长的影响及机制研究

孟永生

目的研究番茄红素(Lycopene，LP)对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响并初步探讨其机制。方法取处于对数生长期的人骨肉瘤MG-63细胞，设空白对照组，LP低、中、高剂量组(5、10、20 μg/mL)和顺铂(40 μg/mL)组；给药干预48 h，观察细胞生长状况，MTT比色法检测细胞增殖抑制率，流式细胞术(Flow cytometry，FCM)检测细胞周期、细胞凋亡状况并计算凋亡率，逆转录PCR(RT-PCR)法检测凋亡相关基因Bax mRNA、bcl-2 mRNA表达并计算Bax/bcl-2值，免疫蛋白印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白caspase-3表达。结果光学显微镜下观察可见，空白对照组人骨肉瘤MG-63细胞呈贴壁生长，增殖迅速，而LP组细胞增殖受到抑制，细胞数明显减少，呈现回缩、脱落现象。与空白对照组比较发现经LP干预48 h能够显著提高人骨肉瘤MG-63细胞增殖抑制率，显著延长细胞周期G0/G1期并缩短S期、G2/M期，显著提高细胞凋亡率(Apoptosis index，AI)，上调Bax mRNA表达并下调bcl-2 mRNA表达，显著提高Bax/bcl-2比值，显著上调caspase-3蛋白表达，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论LP具有抑制人骨肉瘤细胞增殖并促进其凋亡的药理学作用，机制可能与阻滞细胞周期和影响凋亡调控基因、蛋白表达有关。

番茄红素；骨肉瘤细胞；增殖；凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

骨肉瘤多发于青少年，其发病率高、预后差、生存期短，是临床上亟待解决的医学难题之一。番茄红素(Lycopene，LP)是一种具有多种生物学活性的类胡萝卜素[1-2]，近年来LP抗肿瘤作用逐渐得到广大医药研究者的普遍关注。既往研究发现，LP对肺癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞生长均表现出一定的抑制作用[3-5]，抑制细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡和阻滞细胞周期是其主要的作用机制，但LP是否对骨肉瘤细胞生长具有一定的抑制作用尚未见文献报道，本研究通过体外培养人骨肉瘤MG-63细胞并给予LP进行干预，并对比顺铂组疗效，探讨分析LP对人骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物与试剂

人骨肉瘤MG-63细胞株由河北医科大学细胞生物研究室惠赠；LP购自南京泽朗生物科技有限公司(批号：20141218，纯度≥96%)；顺铂注射液购自江苏豪森药业股份有限公司；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；caspase-3单抗购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与分组 人骨肉瘤MG-63细胞株经常规解冻复苏后使用DMEM高糖培养基进行培养，取对数生长期细胞，滴加10%胰酶进行消化处理，然后调整细胞浓度为5×104/mL，分别设空白对照组，LP低、中、高剂量组(5、10、20 μg/mL)和顺铂(40 μg/mL)组，每组设10个复孔。

1.2.2 光学显微镜观察细胞生长状态以及MTT法检测细胞增殖抑制率 给药48 h后，各组细胞通过倒置光学显微镜观察生长状态。MTT法检测细胞增殖抑制率：将人骨肉瘤MG-63细胞接种于96孔培养板，每组设6个复孔，每孔加入 MTT(5 mg/mL)20 μL，37℃孵育4 h后，去上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡 15 min后，酶标仪于波长490 nm处测定吸光度(OD)，计算公式：细胞增殖抑制率(%)=[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%

1.2.3 FCM法检测细胞周期和细胞凋亡状况 遵照流式细胞术检测试剂盒操作方法步骤，各组细胞经PBS洗涤3次后分别加入70%乙醇5 mL，置4℃环境48 h后离心取细胞，加5 μL浓度为10 mg/mL的水解酶Rnase，37℃放置1 h后加入碘化丙啶染液，避光孵育30 min后行FCM检测，通过CELL Quest软件检测分析细胞周期时相及凋亡状况。

1.2.4 RT-PCR法检测bcl-2 mRNA、bax mRNA表达 查询并设计合成大鼠bcl-2、Bax、β-actin基因上、下游引物(Bcl-2引物上游：5′-CCTTTGTGTAACTGTACGGCC-3′，下游：5′-CTTTGGCAGTAAATAGCTGATTCGAC-3′，扩增片段长度317bp；Bax引物上游：5′-GGATGCGTCCACCAAGAA-3′，下游：5′-TCCCGGAGGAAGTCC ATT-3′，扩增片段长度282bp；β-actin引物上游：5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAA-3′，下游：5′-AAAGAAAGGGAGTAAACCGCA-3′，扩增片段长度432bp)。经胰酶消化并收集各组细胞，加入适量TRIzol试剂提取总RNA并测定浓度，反转录为cDNA后行PCR反应，扩增完毕后取PCR产物于琼脂糖凝胶电泳，最后通过凝胶成像仪观察并照相。以β-actin为内参，通过对比条带灰度值半定量分析bcl-2mRNA、Bax mRNA表达并计算Bax/bcl-2值。

1.2.5 Western blot法检测caspase-3蛋白表达 各组细胞加入冷裂解液后行超声裂解，恒温4℃低温离心(转速12 000 rpm，20 min)取沉淀，BCA法检测蛋白浓度，沸水浴加热5 min行蛋白变性后上样(30 μg)，经SDS-PAGE凝胶电泳后转PVDF膜，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，滴加一抗(1∶500)caspase-3、β-actin 4℃过夜，洗膜、二抗(1∶100)室温孵育1 h后经ECL系统显影；以β-actin为内参，通过对比条带灰度值半定量分析caspase-3蛋白表达。

1.3 统计学处理

实验数据运用SPSS 17.0软件进行数理统计分析，计量资料多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞生长状态观察结果

空白对照组细胞呈贴壁生长、增殖迅速，生长状态良好；较空白对照组，LP各干预组和顺铂组细胞生长状态较差：细胞增殖受到抑制，细胞数明显减少，呈现回缩、脱落现象，其中以LP高剂量组细胞生长状态最差(图1)。

2.2 各组细胞增殖抑制率测定结果

较空白对照组，LP各剂量组和顺铂组人骨肉瘤MG-63细胞增殖抑制率均显著升高(P<0.01)；较顺铂组，LP高剂量组细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)(表1)。

图1 各组细胞生长状况Figure 1 The cell growth status in each groupNote：A.The cells in the control group；B.The cells in the low dose of LP group；C.The cells in the medium dose of LP group；D.The cells in the high dose of LP group；E.The cells in the Cisplatin group.

表1 LP对细胞增殖的抑制率Table 1 The inhibitory rate of MG-63 cells treated with LP or Cisplatin(±s)

Note：**P<0.01，compared to the control group；△P<0.05，compared to the Cisplatin group.

2.3 各组细胞周期测定结果

较空白对照组，LP中、高剂量组人骨肉瘤MG-63细胞周期G0/G1期均显著延长(P<0.05)，S期和G2/M期显著缩短(P<0.05)；顺铂组G2/M期显著缩短(P<0.01)；与顺铂组比较，LP高剂量组G0/G1期显著延长且S期、G2/M期显著缩短(P<0.05)(表2)。

表2 LP对细胞周期的影响Table 2 The distribution of cell cycle in MG-63 cells treated with LP or Cisplatin(±s)

Note：*P<0.05，**P<0.01，compared to the control group；△P<0.05，compared to the Cisplatin group.

2.4 各组细胞凋亡状况及凋亡指数(AI)结果

较空白对照组，LP各组和顺铂组人骨肉瘤MG-63细胞凋亡数明显增多，其中以LP高剂量组最为显著(图2)；计算AI结果如表3所示，较空白对照组，LP各组和顺铂组人骨肉瘤MG-63细胞AI显著升高(P<0.01)，其中LP高剂量组AI显著高于顺铂组(P<0.01)。

图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡状况Figure 2 The apoptosis in MG-63 cells treated with LP or CisplatinNote：A.The cells in the control group；B.The cells in the low dose of LP group；C.The cells in the medium dose of LP group；D.The cells in the high dose of LP group；E.The cells in the Cisplatin group.

表3 不同浓度LP对细胞凋亡指数的影响Table 3 The apoptotic index(AI)in MG-63 cells treated with LP or Cisplatin(±s)

Note：**P<0.01，compared to blank control group；△△P<0.01，compared to cisplatin group.

2.5 bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达检测和Bax/bcl-2比值

较空白对照组，LP中、高剂量组和顺铂组MG-63细胞凋亡相关基因bcl-2 mRNA表达显著下调、Bax mRNA显著上调(P<0.05)，Bax/bcl-2值显著提高(P<0.05)；较顺铂组，LP高剂量组bcl-2 mRNA表达显著降低(P<0.05)、Bax mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)、Bax/bcl-2值显著升高(P<0.05)(表4)。

表4 各组细胞bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达Table 4 mRNA levels of Bax and bcl-2 were detected in MG-63 cells treated with LP or Cisplatin(±s)

Note：*P<0.05，**P<0.01，compared to the control group；△P<0.05，compared to the Cisplatin group.

2.6 各组细胞caspase-3蛋白表达检测结果

较空白对照组，LP低、中、高剂量组和顺铂组MG-63细胞caspase-3蛋白表达显著上调(P<0.01)；较顺铂组，LP高剂量组caspase-3蛋白表达量升高(P<0.05)(图3，表5)。

图3 各组细胞caspase-3蛋白表达Figure 3 The expression of caspase-3 protein in MG-63 cellsNote：A.The control group；B.The low dose of LP group；C.The medium dose of LP group；D.The high dose of LP group；E.The Cisplatin group.

表5 各组细胞caspase-3蛋白表达Table 5 The expression of caspase-3 protein was detected in MG-63 cells treated with LP or Cisplatin(±s)

Note：*P<0.05，**P<0.01，compared to the control group；△P<0.05，compared to the Cisplatin group.

3 讨论

骨肉瘤患者每年新发约50/10万[6]，且多发于青少年，临床上主要采取早期截肢手术辅以术前术后化疗的治疗方案，但80%的患者因确诊时体内已经出现转移病灶而致使疗效不佳[7]，5年生存率仅30%左右。因此，以抑制骨肉瘤细胞生长为切入点研究高效、低毒的新型抗肿瘤药物仍是医药工作者迫待解决的问题。

LP具有多种生物学活性[1-2]，近年来LP的抗肿瘤活性逐年得到人们的关注，张玉江等[3]等研究发现LP能够抑制人肺癌H520细胞的侵袭和迁移从而抑制肺癌细胞的扩散；范现英等[8]总结分析发现LP具有增强机体免疫力、诱导胃癌细胞凋亡的作用；于海荣等[9]通过体外细胞实验研究发现LP通过改变膜电位、诱导氧化应激反应来抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖；鲁昊等[10]通过体外培养人喉癌Hep-2细胞并给予LP进行干预研究发现，LP能够通过改变细胞周期来起到抑制Hep-2细胞增殖的作用。本实验研究发现，经LP干预48 h能够将人骨肉瘤MG-63细胞周期显著阻滞于G0/G1期，抑制细胞生长增殖并促进其凋亡，并且LP 20 μg/mL组上述药理学作用优于顺铂40 μg/mL组；提示LP具有抑制人骨肉瘤细胞增殖并促进其凋亡的作用。

caspase-3参与细胞凋亡的启动及整个凋亡过程的调节，在细胞凋亡的调控过程中发挥着重要作用；而Bcl基因家族中的bcl-2能够抑制线粒体破裂，可直接与多种凋亡刺激因子结合而抑制caspase-3激活，并且抑制促凋亡蛋白Bax细胞毒性作用，调节细胞内钙浓度，从而起到抑制细胞凋亡的作用[11]；Bax具有诱导线粒体渗透性改变从而释放细胞色素C、激活促凋亡蛋白caspase-9的作用，表现出促细胞凋亡作用[12]。此外，Bax能够与bcl-2聚合成二聚体而互相抑制活性，因此Bax/bcl-2比值更加能够反应二者对细胞凋亡的调控作用[13]。本实验研究发现，经LP干预48 h后，能够有效上调人骨肉瘤MG-63细胞caspase-3蛋白表达，上调Bax mRNA表达、下调bcl-2 mRNA表达，提高Bax/bcl-2比值，并且LP 20 μg/mL组对caspase-3、bcl-2 mRNA及Bax/bcl-2的表达调控作用均优于顺铂组。

综上所述，LP对人骨肉瘤细胞生长起到一定的抑制作用，机制可能与LP阻滞细胞周期于G0/G1期以及调节凋亡调控相关基因和蛋白表达有关。

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Effectoflycopeneonthegrowthofhumanosteosarcomacellsanditsmechanism

MENGYongsheng

Wu′an First People ′s Hospital，Handan 056300，China

ObjectiveThe objective of this study was to investigate the effect of lycopene(LP)on the proliferation and apoptosis of human osteosarcoma MG-63 cells and to explore its mechanism.MethodsMG-63 cells in the logarithmic growth phase were treated with LP(5，10 and 20 μg/mL)or Cisplatin(40 μg/mL)for 48 h.No LP or Ciplatin treatment was as the control group.The cell growth status was observed and the cell proliferation was measured by MTT colorimetric assay.Flow cytometry(FCM)was used to detect the cell cycle and apoptosis of MG-63 cells and the apoptotic rate was calculated in this study.Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to measure mRNA levels of Bax and bcl-2，and calculate the ratio of Bax/bcl-2 in MG-63 cells.Western blot also was used to examine the expression of caspase-3 protein in MG-63 cells.ResultsMG-63 cells were adherent and proliferated rapidly in the control group.The cells in LP treated groups showed that the cell proliferation was inhibited and the number of cells was significantly decreased，with retraction and detaching.The inhibitory rate of MG-63 cells in LP treated group were significantly increased when compared to the control group.LP significantly prolonged the cell cycle at the G0/G1phase and shortened the cell cycle at the S and G2/M phase.LP also significantly increased the apoptosis rate，up-regulated the mRNA level of Bax，down-regulated the mRNA level of bcl-2，increased the ratio of Bax/bcl-2 and the expression of caspase-3 protein in MG-63 cells(P<0.05 orP<0.01).ConclusionLP may effectively inhibit the proliferation of MG-63 cells and promote the apoptosis.The mechanism may be related to the cell cycle and the regulation of apoptosis and gene expression.

Lycopene；Osteosarcoma；Proliferation；Apoptosis；Caspase-3

武安市第一人民医院(邯郸 056300)

孟永生，男，(1964-)，本科，副主任医师，从事骨科疾病的研究。

孟永生，E-mail：chaixuze666@163.com

R738.7

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.06.005

(收稿：2017-06-14)