沉默UHRF1对乳腺癌细胞增殖和转移的影响

陈 琢 孔艺然

沉默UHRF1对乳腺癌细胞增殖和转移的影响

陈 琢 孔艺然

目的探讨UHRF1对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖以及侵袭的影响及其相关机制。方法采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测沉默UHRF1基因后对乳腺癌MDA-MB-231细胞活力的影响；应用克隆形成实验检测沉默UHRF1后对乳腺癌MDA-MB-231细胞存活的影响；吖啶橙-溴乙锭(AO/EB)检测沉默UHRF1后对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响；Caspase-3活性试剂盒检测沉默UHRF1后乳腺癌细胞Casapse-3活性的变化；Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bad、p-Bad、XIAP、p53、p21Cip1/Waf1和p16INK4a的表达；应用Transwell实验研究沉默UHRF1对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响；Wound Healing实验研究沉默UHRF1后对其迁移能力的影响。结果沉默UHRF1使乳腺癌MDA-MB-231细胞活力降低；克隆形成实验结果显示沉默UHRF1后MDA-MB-231细胞存活能力降低，AO/EB染色显示沉默UHRF1促进MDA-MB-231细胞凋亡。同时Caspase-3活性实验结果显示沉默UHRF1后乳腺癌MDA-MB-231细胞Caspase-3的活性增加；Western blot结果显示，沉默UHRF1后，能够使凋亡蛋白Bad、XIAP和Bax的表达上调，同时抗凋亡蛋白p-Bad，Bcl-2的表达下调，也使p53，p21Cip1/Waf1，p16INK4a蛋白表达升高；Transwell以及Wound Healing实验证明沉默UHRF1能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭和迁移。结论沉默UHRF1能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞活力和存活，并抑制乳腺癌MDA-MB-231的侵袭和迁移。沉默UHRF1通过调控p53，p21Cip1/Waf1，p16INK4a信号发挥作用。

UHRF1；乳腺癌；p53；侵袭；凋亡

乳腺癌(Breast cancer)是世界范围内女性较常见的恶性肿瘤之一[1]。尽管目前临床对于乳腺癌的治疗主要集中于手术和放化疗[2-3]，但因其对患者的损伤大，术后对于女性心理以及生理的影响巨大[4]。因此，进一步研究乳腺癌的致病因素和发生机制，明确靶向治疗方向[5]，是目前困扰广大学者的重要研究问题。UHRF1，也被称为ICBP90，属于UHRF家族[6]。UHRF1被发现在前列腺癌[7]、膀胱癌[8]和乳腺癌[9]中过量表达，但是其确切的生物学功能仍然被学者们所关注。文献报道[10]体外实验中UHRF1基因可能是一种生长调节基因，其主要作用在于能够抑制细胞有丝分裂从而对细胞增殖产生影响，进而对细胞周期进行调节。然而，关于UHRF1对乳腺癌细胞增殖的具体影响鲜有报道。本研究主要探讨沉默UHRF1后，乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖以及迁移能力的变化，及其初步机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌细胞系用RPMI-1640(含10%小牛血清)培养基于37℃、5% CO2条件下培养。UHRF1-shRNA购自中国Gene Pharma公司。抗Bcl-2、抗Bax、抗Bad、抗p-Bad、抗p53，抗p21Cip1/Waf1以及p16INK4a单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 分组 将正常对照组，NC组以及UHRF1-shRNA组分别转染到MDA-MB-231细胞中(NC组：阴性对照组；UHRF1-shRNA组，转染UHRF1-shRNA 48 h后的MDA-MB-231细胞)，Western blot方法检测转染后UHRF1蛋白的变化，发现NC组与正常对照组相比没有统计学差异(P=0.0923)，因此在后续的实验中，本研究以NC组为对照组(图1A)。

1.2.2 MTT法测定MDA-MB-231细胞生长抑制率 将2×103L-1的MDA-MB-231细胞接种于96孔板中，贴壁培养24 h后，分别向MDA-MB-231细胞中转染UHRF1-shRNA及NC 48 h后，MTT法测定细胞的吸光度值。

1.2.3 Caspase-3活性检测 向MDA-MB-231细胞中转染UHRF1-shRNA，48 h后，按照Caspase-3活性检测试剂盒说明书测定Caspase-3的酶活性。

1.2.4 Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白的表达 总蛋白是从转染UHRF1-shRNA及其NC 48 h后MDA-MB-231细胞中提取。使用12%的SDS-PAGE胶，每个孔道蛋白样品50 μg，浓缩胶70 V，分离胶110 V后，将蛋白转印至醋酸纤维素膜上，300 mA转印1.5 h后，在5%的脱脂牛奶中封闭2 h。分别将不同的抗体p16INK4a、p21CIP1/WAF1、p53、Bcl-2、Bax、Bad、p-Bad、XIAP、β-actin在4℃恒温摇床上孵育过夜，红外荧光染料标记的第二抗体室温孵育1 h。Western blot通过奥德赛3.0软件进行红外成像系统采集，以相应蛋白条带的灰度值/β-actin蛋白条带的灰度值表示相对蛋白含量。

1.2.5 吖啶橙-溴乙锭(AO/EB)染色法检测细胞生存 将MDA-MB-231细胞培养于灭菌的玻片上24 h。瞬时转染UHRF1-shRNA 48 h。加入吖啶橙-溴乙锭混合液染色100 mg/mL的AO以及100 mg/mL的EB融于PBS中。用荧光显微镜检测细胞形态的变化(100×)。细胞凋亡率用以下公式检测：凋亡率(%)=凋亡细胞数/细胞总数。

1.2.6 Transwell法检测侵袭能力的影响 将5×104个细胞加入无血清培养基的上室，接种前需提前铺设Matrigel胶，加入1×104个细胞于血清培养基的上室，下室均为含10%胎牛血清的培养基。24 h后取出小室，依次经甲醛固定及结晶紫染色，采用倒置显微镜计算侵袭或迁移细胞数，实验重复3次。

1.2.7 划痕实验 将乳腺癌细胞接种至6孔板中，分别转染NC组与UHRF1-shRNA组12 h后，待细胞完全贴壁，使用10 μL的枪头对两组细胞进行划痕，磷酸盐缓冲液清洗细胞并拍照观察，100倍视野下随机选择3个视野进行记录划痕宽度。24 h后再拍照观察，记录划痕宽度。

1.3 数据处理分析

用GraphPad Prism 5.0软件处理数据，计量资料采用t检验，Kruskal-wallis秩和检验或Wilcoxon秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 沉默UHRF1后乳腺癌MDA-MB-231细胞活性的变化

UHRF1-shRNA与NC分别转染到MDA-MB-231细胞中作用48 h后，Western blot方法检测其敲减效率(图1A)。MTT方法检测转染UHRF1-shRNA后细胞活性的变化，分别与正常对照组以及NC组相比，UHRF1-shRNA转染组细胞活性相较于正常对照组(50.28+3.89)%以及NC组(48.36+5.80)%(P<0.05)有所降低(图1B)。通过AO/EB染色法和克隆形成实验检测MDA-MB-231增殖能力，发现与NC相比，UHRF1-shRNA组乳腺癌细胞增殖能力明显降低(P<0.05)(图1C，图1D)。

图1 沉默UHRF1后对乳腺癌MDA-MB-231细胞活性的影响Figure 1 Knockdown UHRF1 affected the viability of MDA-MB-231 cellsNote：A.MDA-MB-231 cells were transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA and siRNA-depletion efficiency was examined by Western blot；B.MDA-MB-231 cells transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA were cultured and cell viability was analyzed by MTT assay；C.MDA-MB-231 cells transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA were subjected to AO/EB staining to detect changes in the nucleus.The orange-colored region indicated initiation of apoptosis；D.MDA-MB-231 cells transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA were seeded into 6-cm dishes at a density of 800 cells/dish.Colony formation was assessed by crystal violet staining.*P<0.05 vs.control or NC group.

2.2 沉默UHRF1对Caspase-3通路的影响

本研究首先检测了线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax(图2A)、Bad与p-Bad(图2B)的表达，结果发现相对于NC组，沉默UHRF1后Bax与Bcl-2比值显著上调(P=0.0233)，Bad蛋白表达相较于NC组显著上调(P=0.0451)，而p-Bad蛋白相对于NC组显著下调(P=0.0315)。同时通过Caspase-3的活性检测，发现与NC组相比，转染UHRF1-shRNA后MDA-MB-231细胞Caspase-3活性显著升高(P=0.0194)(图2C)，说明沉默UHRF1能够抑制MDA-MB-231细胞增殖是依赖于Caspase-3的活化。随后本研究又检测了XIAP蛋白的表达，相对于NC组，沉默UHRF1后XIAP蛋白的表达显著上调(P=0.0412)(图2D)。

图2 沉默UHRF1对于Bax，Bcl-2(A)Bad，p-Bad(B)以及Xiap(D)蛋白影响，及其对于caspase-3活性的改变Figure 2 Knockdown UHRF1 altered the expression of p-Bad，Bad，Bax，Bcl-2 and XIAP，and promoted caspase-3 activation in MDA-MB-231 cellsNote：Western blot was used to detect Bax，Bcl-2(A)，p-Bad，Bad，(B)and XIAP(D)expression in MDA-MB-231 cells transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA.Relative expression of Bax，Bcl-2，p-Bad，Bad and XIAP was normalized to β-actin.n=3 independent experiments for each group.(C)Activation of caspase 3 by UHRF1-shRNA or NC-shRNA.Data are averaged from five independent experiments for each group.*P<0.05 vs.NC group.

2.3 沉默UHRF1对于乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力的影响

Transwell以及Wound Healing实验检测沉默UHRF1对于细胞侵袭和迁移能力的影响，结果显示UHRF1能够明显的抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭和迁移能力，说明UHRF1参与了MDA-MB-231的侵袭和迁移过程(图3A，B)。

2.4 沉默UHRF1对于p53信号通路的影响

为进一步验证UHRF1是否通过p53信号通路影响MDA-MB-231细胞增殖及侵袭，结果发现与NC组相比，UHRF1-shRNA组中p53，p21Cip1/Waf1，p16INK4a蛋白的表达显著上调(P<0.05)(图4)。

图3 转染UHRF1-shRNA对于乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力的影响Figure 3 UHRF1 shRNA inhibited the migration of MDA-MB-231 cellsNote：MDA-MB-231 cells were transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA.(A)Wound-Healing assay was performed to analyze the effect of UHRF1 on cell migration.Representative images(100×)and quantitative analyses are shown；(B)Transwell assay in the presence or absence of matrigel was performed.*P<0.05 vs. NC group.

图4 UHRF1-shRNA对于乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞凋亡通路的影响Figure 4 Knockdown UHRF1 increased the expression of p53，p21Cip1/Waf1 and p16INK4a in MDA-MB-231 cellsNote：A.p53 protein level；B.p21Cip1/Waf1 protein level；C.p16INK4a protein level.*P<0.05 vs.NC group.

3 讨论

UHRF1基因是近些年深受广大学者关注的一个凋亡相关基因[11]。目前，很多研究表明，其广泛参与各种生物学过程，包括表观遗传调控[12]、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动，成为遗传学研究热点。现有的文献报道，UHRF1对于肝癌[13]和胃癌[14]的发生发展有着巨大的影响。但是其对于乳腺癌增殖、侵袭的影响并没有太多的相关报道，本研究主要通过沉默UHRF1来研究其对乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖的作用及其相关机制。

过度增殖是恶性肿瘤发生发展的重要环节[15]。本结果显示，沉默UHRF1后，MDA-MB-231细胞的生存率均低于正常水平，表明沉默UHRF1能够抑制乳腺癌细胞的增殖，克隆形成以及AO/EB的结果均印证了UHRF1能够影响乳腺癌细胞系MDA-MB-231的活性。现有的文献[16]大多关于过表达UHRF1后对于增殖能力影响的研究，但是对于乳腺癌的研究鲜有报道。此外，本研究进一步发现沉默UHRF1基因后，MDA-MB-231细胞的增殖能力明显降低，表明UHRF1对调节乳腺癌细胞的增殖过程起到一定作用。

迁移和侵袭是肿瘤发生发展过程中重要的环节[17]。肿瘤细胞的迁移和侵袭能力与乳腺癌的预后密切相关，也是导致治疗失败的主要原因。本研究采用Transwell和WoundHealing实验检测发现沉默UHRF1后，MDA-MB-231细胞的侵袭迁移能力受抑制，表明UHRF1与乳腺癌细胞的恶性生物学行为有关。

p53基因突变被认为是目前所有人体肿瘤中最常见的基因改变。p53基因定位于染色体17p13.1，对细胞周期DNA的修复、合成、细胞分化、基因组的稳定和细胞的凋亡起调控作用，p53通过对多种基因的调控引起G1、S和G2期停顿从而调控凋亡。Huang等[18]证明p53能够参与到乳腺癌细胞凋亡的过程。Cao等[19]的研究同时证明了p53能够参与到乳腺癌的侵袭。而本研究结果表明沉默UHRF1后能够使p53蛋白表达上调，同时p53信号通路中重要蛋白p21Cip1/Waf1和p16INK4a蛋白表达也上调。

综上所述，沉默UHRF1后，能够抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖，同时也能够抑制其侵袭的能力。而这种抑制增殖和侵袭的能力可能是通过上调Caspase-3活性，进而上调p53蛋白表达，然后激活下游的p21Cip1/Waf1和p16INK4a蛋白而实现的，以上研究为UHRF1对于乳腺癌的治疗提供了理论依据。

1 Rao N，Qiu J，Wu J，et al.Significance of tumor-infiltrating lymphocytes and the expression of topoisomerase IIalpha in the prediction of the clinical outcome of patients with triple-negative breast cancer after taxane-anthracycline-based neoadjuvant chemotherapy[J]，Chemotherapy，2017，62(2)：246-255.

4 Joseph FJ，van Oepen A，Friebe M，et al.Breast sentinel lymph node biopsy with imaging towards minimally invasive surgery[J]，Biomed Tech(Berl)，2017[Epub ahead of print].

5 Treitl D，Radkani P，Rizer M，et al.Adenoid cystic carcinoma of the breast，20 years of experience in a single center with review of literature[J]，Breast Cancer，2017[Epub ahead of print].

6 Hopfner R，Mousli M，Jeltsch JM，et al.ICBP90，a novel human CCAAT binding protein，involved in the regulation of topoisomerase IIalpha expression[J]，Cancer Res，2000，60(1)：121-128.

7 Abu-Alainin W，Gana T，Liloglou T，et al.UHRF1 regulation of the keap1-nrf2 pathway in pancreatic cancer contributes to oncogenesis[J]，J Pathol，2016，238(3)：423-433.

8 Saidi S，Popov Z，Janevska V，et al.Overexpression of UHRF1 gene correlates with the major clinicopathological parameters in urinary bladder cancer[J].Int Braz J Urol，2017，43(2)：224-229.

9 Li XL，Xu JH，Nie JH，et al.Exogenous expression of UHRF1 promotes proliferation and metastasis of breast cancer cells[J].Oncol Rep，2012，28(1)：375-383.

10 Bonapace IM，Latella L，Papait R，et al.Np95 is regulated by E1A during mitotic reactivation of terminally differentiated cells and is essential for S phase entry[J].J Cell Biol，2002，157(6)：909-914.

11 Subramani R，Gangwani L，Nandy SB，et al.Emerging roles of microRNAs in pancreatic cancer diagnosis，therapy and prognosis(Review)[J].Int J Oncol，2015，47(4)：1203-1210.

12 Kang SM，Lee HJ.MicroRNAs in human lung cancer[J].Exp Biol Med(Maywood)，2014，239(11)：1505-1513.

13 Ahmed K，Tabuchi Y，Kondo T.Hyperthermia：an effective strategy to induce apoptosis in cancer cells[J].Apoptosis，2015，20(11)：1411-1419.

14 Chen WM，Huang MD，Sun DP，et al.Long intergenic non-coding RNA 00152 promotes tumor cell cycle progression by binding to EZH2 and repressing p15 and p21 in gastric cancer[J].Oncotarget，2016，7(9)：9773-9987.

15 Li J，Zhang N，Zhang R，et al.CDC5L Promotes hTERT expression and colorectal tumor growth[J].Cell PhysiolBiochem，2017，41(6)：2475-2488.

16 Seo JS，Choi YH，Moon JW，et al.Hinokitiol induces DNA demethylation via DNMT1 and UHRF1 inhibition in colon cancer cells[J].BMC Cell Biol，2017，18(1)：14.

17 Li J，Zhang N，Zhang R，et al.CDC5L Promotes hTERT expression and colorectal tumor growth[J].Cell Physiol Biochem，2017，41(6)：2475-2488.

18 Huang L，Li A，Liao G，et al.Curcumol triggers apoptosis of p53 mutant triple-negative human breast cancer MDA-MB 231 cells via activation of p73 and PUMA[J].Oncol Lett，2017，14(1)：1080-1088.

19 Cao Y，Lin M，Bu Y，et al.p53-inducible long non-coding RNA PICART1 mediates cancer cell proliferation and migration[J].Int J Oncol，2017，50(5)：1671-1682.

EffectofsilencingUHRF1onproliferationandmetastasisofbreastcancercells

CHENZhuo，KONGYiran

Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China

ObjectiveThe objective of this study was to investigate the effect of UHRF1 on the proliferation and metastasis of breast cancer MDA-MB-231 cells and its mechanism.MethodsThe effect of silencing UHRF1 gene on the viability of MDA-MB-231 cells was detected by MTT assay.Colony formation assay was performed to analyze the effect of silencing UHRF1 on cell survival of MDA-MB-231 cells.The effect of silencing UHRF1 on the apoptosis of MDA-MB-231 cells was detected by acridine orange-ethidium bromide (AO / EB).Caspase-3 activity kit was used to detect the expression of caspase-3 in MDA-MB-231 cells.The expressions of Bcl-2，Bax，Bad，p-Bad，XIAP，p53，p21Cip1/Wafand p16INK4awere detectedby Western blot.The abilities of invasion and migration of MDA-MB-231 cells silenced by UHRF1were examined by Transwell and Wound healing assays，respectively.ResultsSilencing UHRF1 significantlydecreased the viability of MDA-MB-231 cells.Silencing UHRF1 decreased colony formation in MDA-MB-231 cells.Depletion of UHRF1 resulted in apoptosis inducedin MDA-MB-231 cells，showing nuclear morphological changes by AO/EB staining and increasing caspase-3 activity.After knockdown of UHRF1，the expression of Bad，XIAP，Bax，p53，p21Cip1/Waf1and p16INK4awas up-regulatedand down-regulated the expression of p-Bad and Bcl-2 in MDA-MB-231 cells.Transwell and wound healing assays demonstrated that silencing UHRF1 could decrease metastasisin MDA-MB-231 cells.ConclusionSilencing UHRF1 can inhibit the viability and survival of MDA-MB-231 cells，and inhibit the invasion and migration of MDA-MB-231 cells regulated by p53/p21Cip1/Waf1/p16INK4asignalings.

UHRF1；Breast cancer；p53；Metastasis；Apoptosis

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院(哈尔滨 150081)

陈琢，女，(1987-)，硕士，住院医师，从事外科疾病的研究。

陈琢，E-mail：zhuochen930@hotmail.com

R737.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.06.006

(收稿：2017-07-14)