原苏木素A对胃癌SGC-7901细胞系放疗增敏作用的研究

刘国慧 谷安鑫 殷洪涛 曹 阳 贺云龙 王春波 鄂明艳

原苏木素A对胃癌SGC-7901细胞系放疗增敏作用的研究

刘国慧 谷安鑫 殷洪涛 曹 阳 贺云龙 王春波 鄂明艳

目的本研究将原苏木素A、苏木醇提物、顺铂分别与放疗联合作用于胃癌细胞SGC-7901细胞系，研究原苏木素A是否增加胃癌SGC-7901细胞系放射敏感性，为临床用药开创更新的领域。方法体外培养人胃癌细胞SGC-7901细胞系，以苏木醇提物、顺铂为对照，MTT法检测原苏木素A对细胞增殖作用的影响，以及其与作用浓度和作用时间的关系；采用克隆形成实验，拟合细胞存活曲线，以单纯放疗组为对比，计算放射增比(SER)，分析原苏木素A的增敏效果。结果原苏木素A对人胃癌细胞SGC-7901有生长抑制作用，但抑制作用相对较弱，其细胞毒性有明显的时间和浓度依赖性。不同作用时间及作用浓度下的细胞形态发生明显的改变。克隆形成实验显示原苏木素A显著增加了SGC-7901细胞的放射敏感性，与单纯放射组对比，差异有统计学意义。结论原苏木素A对胃癌SGC-7901细胞的抑制有浓度和时间的依赖性，联合放射治疗能够提高放射增敏作用，两者可能具有协同抗肿瘤作用。

原苏木素A；苏木醇提物；胃癌；放射治疗；放射敏感性

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率高居全球恶性肿瘤的前4位。我国是胃癌高发区，2015年我国胃癌的发病率和死亡率居恶性肿瘤的第2位[1]。目前，治愈胃癌的主要方法为根治性手术，然而根治术后区域局部复发和远处转移则成为治疗失败的主要原因。因此，术前的放疗、新辅助化疗及术后的同步放化疗等围手术期的辅助治疗越显关键。最近几年，胃癌的放射治疗在不断探索中由开始的姑息性治疗转变为辅助治疗。近年来，逐渐形成以手术治疗为基础，以化疗、放疗、靶向治疗、热灌注治疗等一系列治疗为辅的综合治疗模式[2]。

苏木(Caesal Piia SappanL，cAE)属于一种来源于豆科云实属植物的干燥心材。现代药理学研究表明其具有抗肿瘤、免疫抑制等作用，临床上也用于肿瘤的治疗[3]。研究发现，cAE提纯的重要活性成分可对肿瘤细胞增殖呈现抑制作用、促进肿瘤细胞的凋亡、对肿瘤细胞的侵袭和转移有抑制作用；与部分化学药物联合，可明显提高疗效，同时具有无明显血液系统毒性、逆转肿瘤细胞耐药和提高机体免疫力等作用[4]。临床及体外实验证明，苏木提纯物对包括肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌等多系统肿瘤具有不同程度的抗肿瘤作用[5-6]。基于苏木提纯物具有多“靶点”抗肿瘤作用，为明确其单体成分原苏木素A是否为主要抗肿瘤成分，及其对放疗是否有增敏效应。本研究通过体外实验研究证明原苏木素A对肿瘤细胞的抑制作用及对胃癌放射的增敏作用，为进一步开展原苏木素A与放疗联合应用于胃癌的临床治疗奠定理论基础，并为将来临床中药治疗肿瘤的提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及处理

人胃癌SGC-7901细胞系由黑龙江省肿瘤防治研究所提供。细胞使用含10%新生牛血清的1640培养基培养传代，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。原苏木素A由黑龙江大学生化中心提供。苏木95%醇提物由黑龙江中医药大学药理学系研制并提供。顺铂为江苏奥赛生产。

1.2 放射条件

放射源为哈医大附属肿瘤医院放疗科Elektasynergy直线加速器，能量为4 MeV，剂量率300 cGy/分。照射野充分覆盖培养瓶，照射时将培养瓶细胞面朝上放置，并垫1 cm厚组织补偿膜。

1.3 MTT增殖抑制实验

将原苏木素A用DMSO配制成浓度：100 μM，200 μM，400 μM，800 μM，1600 μM；苏木醇提物用PBS稀释成浓度：50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL。顺铂稀释成浓度为：2 μg/mL，3 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL。细胞计数后将细胞悬液稀释为1×104/mL，按每孔5 000个细胞接种到96孔板，每孔体积约100 μL，每个剂量点设4个复孔，设对照组(仅加培养液，不加细胞)，分别加入相应浓度的原苏木素A、苏木素醇提物及顺铂纯品的培养液，放回培养箱，按培养24 h、48 h及72 h的药物作用时间，相应时间取出96孔板，在避光条件下每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培养箱中继续培养4 h，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，摇床上低速振荡10 min使结晶物充分融合比色。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度(OD)值，同时设置对照孔，记录结果，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.4 克隆形成实验

将培养瓶中指数生长期的SGC-7901细胞消化、离心后，制成单细胞悬液，并按梯度稀释成不同浓度，根据各个剂量点需接种的细胞数将细胞接种于25 cm培养瓶中，设0、2、4、6、8、10 Gy剂量点，每个剂量点设置4个培养瓶，并分成原苏木素A组、苏木醇提物组、顺铂组及对照组。细胞接种后约12 h更换培养液，根据MTT检测结果，计算原苏木素A 400 μM时药物浓度为196.2 μg/μL，原苏木素A 800 μM时药物浓度为392.4 μg/μL，苏木95%醇提物50 μg/mL时药物浓度为90 μM，顺铂2 μg/mL时药物浓度为144 μM。更换培养液后，于培养箱中培养24 h后进行照射，照射后继续培养10～14天，甲醛固定，结晶紫染色，计数>50个细胞的克隆数。计算贴壁率及各剂量点细胞存活率：贴壁率=对照组克隆数/种植细胞数×100%；存活率=(实验组克隆数/种植细胞数×贴壁率)×100%；克隆形成率(PE)=克隆数/接种的细胞数。根据上述计算所得结果按多靶单击方程SF拟合细胞存活曲线，计算增敏比(SER值)，上述实验进行三次重复。

1.5 统计学处理

统计学分析应用SPSS 19.0软件，MTT增殖抑制实验测定三种药物浓度和时间与SGC-7901细胞存活率的关系曲线，克隆形成实验选取多个剂量点来评估细胞放射生物学特征，以此利用单击多靶模型SF=1-(1-e-D/D0)N估计增敏效应，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 原苏木素A和苏木醇提物对SGC-7901细胞的生长抑制作用

MTT实验是检测不同浓度的原苏木素A、苏木醇提物、顺铂分别作用24 h、48 h、72 h后对SGC-7901细胞的生长抑制情况，以观察药物浓度和作用时间对细胞存活率的影响(图1)。通过计算原苏木素A细胞抑制率，可以看出在相同作用时间下，作用24 h时，原苏木素A组最大浓度1 600 μM的细胞抑制率为最小浓度100 μM的-0.99倍；作用48 h时，最大浓度细胞抑制率为最小浓度的2.12倍；作用72 h时，最大浓度细胞抑制率为最小浓度的3.15倍。在相同浓度下，低浓度原苏木素A100 μM 72 h的细胞抑制率为24 h的2.61倍；高浓度1 600 μM 72 h的细胞抑制率为24 h的8.23倍；由此分析出原苏木素A对SGC-7901细胞抑制率呈明显的时间和浓度依赖性(表1，图2)。通过计算，得出原苏木素A 24 h半数生长抑制浓度为1965 μmol/L，72 h为119 μmol/L，其中不同组别半数生长抑制浓度IC50对比见表2。进一步分析出三种药物对SGC-7901细胞的抑制作用为顺铂>苏木醇提物>原苏木素A。

图1 MTT法测定三种药物浓度和时间与SGC-7901细胞存活率的关系曲线Figure 1 Relationship between survival rates and doses of three drugs in SGC-7901 cells for different time-point treatmentsNote：The logarithmic-effect curve respectively Protosappanin A(A)Caesalpinia Sappan L Extract(B)Cisplatin(C)that acting on 24 h，48 h and 72 h.

表1 MTT法测定三种药物不同作用剂量及时间的平均抑制率Table 1 The average inhibitory rates of three drugs in SGC-7901 cells for different time-point treatments

表2 MTT法测定三种药物不同作用时间的半数抑制浓度Table 2 Median concentration of three drugs in SGC-7901 cells

Note：IC50：Median inhibitory concentration；P<0.05.

图2 原苏木素A对细胞抑制率关系曲线图Figure 2 Inhibitory rates of Protosappanin A in SGC-7901 cells

2.2 原苏木素A放射增敏作用

根据克隆形成实验拟合出SGC-7901的细胞存活曲线(图3)。结果表明，单纯接受400 μM及800 μM原苏木素A孵育24 h后，细胞的贴壁率与对照组无显著性差异，但在分别接受了2、4、6、8、10 Gy的剂量照射后，原苏木素A孵育组细胞的存活分数随放射剂量的增加明显下降。细胞存活曲线的生物学参数见表3。通过与单纯放疗组做对比，计算出原苏木素A高剂量组的增敏比为1.29。实验结果说明三种药物对SGC-7901细胞的放射增敏作用为原苏木素A 800 μM>顺铂>原苏木素A 400 μM>苏木醇提物。

图3 联合作用组和对照组SGC-7901细胞的存活曲线Figure 3 Survival curves of SGC-7901 cells treated with PrA with radiotherapyNote：R：Radiotherapy alone；AR(HP+R)：High dose of PrA with radiotherapy；BR(P+R)：Cisplatin with radiotherapy；CR(LP+R)：Low dose of PrA with radiotherapy；DR(E+R)：Caesalpinia Sappan L Extract with radiotherapy.

表3 联合作用组和对照组SGC-7901细胞存活曲线的相关参数Table 3 Parameters of drug combined with radiotherapy in SGC-7901 cells

Note：P=0.04.D0：Mean lethal dose；Dq：Quasithreshold dose；D37：the corresponding radiation dose that the cell survival rate was 37%；SF2：Surviving fraction at 2 Gy；SER：Sensitivity enhancement ratio.

3 讨论

据统计，全世界每年胃癌发生在中国的新发病例高达40%以上[7]，虽然手术及术后的放化疗可以改善患者的预后，新一代化疗药物也不断涌现，放疗技术不断进步，但是放化疗的5年生存率仍无显著提高[8]，因此寻找新的有效治疗策略势在必行。

随着放射治疗技术的发展，以及化疗药物的不断更新，放/化综合治疗也在不断进步，其理论基础就是基于两者的空间协同作用，即放射治疗针对局部和区域病变，而化疗作为全身治疗能够杀灭或控制转移病变[9-10]。但是，放、化同时进行，也会增加全身毒性或局部毒性反应，当今抗肿瘤药物研发的热点可追随于应用中草药研究疗效高、低毒性的抗肿瘤药物[11]。苏木素在多种实验中被证实有抗肿瘤作用，但是是何种成分起到主要的抗肿瘤作用尚未清楚[12-14]。因此为研究其成分原苏木素A对肿瘤细胞的生长抑制作用及是否有放射增敏效果，本研究以人胃癌SGC-7901细胞系为主要研究对象，进行了相关研究。通过MTT实验，发现原苏木素A对SGC-7901细胞的生长抑制作用较弱，最大药物浓度的抑制率不超过30%，这至少说明原苏木素A对体外培养细胞的抗肿瘤作用较弱。但随着作用时间的增加，抑制率逐渐增加。MTT染色后，孔板底部可见少量的蓝紫色结晶物质，且随着时间的推移及剂量的增加，蓝紫色逐渐变浅，这也说明药物作用后该细胞系呈现出明显的抑制作用，上述观察结果均表明原苏木素A作用于SGC-7901细胞上的抑制作用有时间依赖性和浓度依赖性。本研究结果也说明，单独使用原苏木素A的抗肿瘤作用较弱，不适合作为独立的治疗药物，而应用于放化疗联合，会增加放化疗的杀伤作用。

通过放射生物学测定肿瘤干细胞增殖能力的有效方法常为克隆形成实验，这种由单个细胞不断复制形成的细胞群体称为克隆或集落[15]。通过克隆形成实验我们选取多个剂量点来评估细胞放射生物学特征，以此利用单击多靶模型SF=1-(1-e-D/D0)N估计增敏效应[16]。本实验数据结果显示接受400 μM及800 μM原苏木素A孵育24 h后，细胞的贴壁率与对照组无显著性差异，但在接受了2～10 Gy的剂量照射后，原苏木素A孵育组细胞的细胞存活分数明显下降。放射抗拒的SGC-7901细胞在大剂量原苏木素A作用后，其放射敏感性增加，800 μM放射增敏比为1.29。评判某种增敏方法效能的大小，通常是通过增敏比(SER)来衡量的，如有增敏效果，则指标结果SER>1.0(P<0.05)，增敏效果越明显，其数值越大[17]。通过实验结果说明三种药物对SGC-7901细胞的放射增敏作用为原苏木素A 800 M>顺铂>原苏木素A 400 μM>苏木醇提物。因此说明原苏木素A对SGC-7901细胞系的克隆源性细胞的抑制作用较弱，但通过放射敏感性的增加使肿瘤细胞存活减少。

综上所述，本研究通过胃癌SGC-7901细胞的体外研究，证实了原苏木素A对胃癌细胞放射增敏的作用，其具体机制有待于进一步研究。因顺铂为常用化疗药物，但其毒副作用较大，而原苏木素A为苏木素提取成分，其生物活性广，低毒，因此是否可以替代细胞毒类化学药物，广泛应用于临床作为放射增敏剂尚需通过临床试验研究。

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ProtosappaninAincreasesthesensitivityofgastriccancerSGC-7901cellstoradiotherapy

LIUGuohui，GUAnxin，YINHongtao，CAOYang，HEYunlong，WANGChunbo，EMingyan

Department of Radiation Oncology，Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China

ObjectiveIn this study，Protosappanin A，Caesalpinia Sappan L extract and Cisplatin were combined with radiotherapy in gastric cancer cell SGC-7901 to investigate whether the Protosappanin A could increase radiosensitivity(SER)in gastric cancer SGC-7901 cells.This will be medication to create new areas of innovation in the future.MethodsThe cell proliferation of SGC-7901 cells was detected by MTT assay.The relationship between the effect of the Protosappanin A on cell proliferation and the time of action was determined.Caesalpinia Sappan L extract and Cisplatin were as controls.The fitted cell survival curve and clonal formation assays were used to determine the SER to analyze the sensitizative effect of Protosappanin A.ResultsProtosappanin A could inhibit the growth of SGC-7901 cells，and its inhibitory effect is relatively weak.Its cytotoxicity has a time-and concentration-dependent manner.Cellular morphological changes were observed accompanying with increased concentrations and time treatments of Protosappanin A.Clonal formation experiment showed that the Protosappanin A significantly increased the radiosensitivity of SGC-7901 cells when compared to the radioactive group.They showed a statistically difference.ConclusionThe inhibitory effect of the Protosappanin A on SGC-7901 cells in a concentration and time-dependent manner.Protosappanin A combined radiotherapy can improve the radiosensitization of cells，both of which may have synergistic anti-tumor effect.

Protosappanin A；Caesalpinia Sappan L extract；Gastric cancer；Radiotherapy；Radiosensitivity

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院胸部放疗二病区(哈尔滨 150081)

刘国慧，女，(1989-)，硕士，住院医师，从事胸腹部肿瘤放射治疗的研究。

鄂明艳，E-mail：emingyansci@126.com

R285.6；R730.5

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.06.004

(收稿：2017-05-21)