鸟苷酸交换因子ARHGEF 10功能鉴定及其与肿瘤恶性表型间的关系研究

唐秋琳 毕 锋

·基础研究·

鸟苷酸交换因子ARHGEF 10功能鉴定及其与肿瘤恶性表型间的关系研究

唐秋琳 毕 锋

目的Dbl家族鸟苷交换因子(GEFs)是Rho家族蛋白发生恶性转化的主要调控单位，它通过使Rho蛋白从无活性的GDP形式转换为GTP形式的Rho蛋白而发挥作用。本研究对一个GEF分子-ARHGEF 10进行了结构和功能上的初步探究，对该分子在肿瘤发展过程中扮演的角色进行讨论。方法Realtime PCR对ARHGEF 10在人体42种正常组织中的表达情况进行了测定；GST-pulldown技术对ARHGEF 10的体内GEF活性进行了检测；双荧光素酶报告基因检测技术对下游小分子进行转录因子活性检测；应用免疫荧光双染标记法完成了高表达ARHGEF 10对正常细胞骨架形态的影响；在细胞表型实验中分别使用CCK8法、Transwell法及软琼脂克隆形成实验检测了高表达ARHGEF 10对细胞增殖侵袭迁移及体外成瘤能力的影响。结果生物信息学分析结果显示ARHGEF10分子量为156 kD，具有典型的Dbl家族分子结构域，在肺组织中表达量最高，能够促使正常成纤维细胞中的应力纤维(Stress fiber)增多，同时促进细胞增殖、侵袭及克隆形成，体外转录因子活性检测发现该基因可能与JAK/STAT通路有关。结论ARHGEF 10是一个典型的鸟苷交换因子家族分子，能激活Rho家族分子RhoA，具有明显的癌基因特征。

鸟苷酸交换因子；ARHGEF 10；Dbl家族；Rho家族；癌基因

Rho家族GTP酶通过对细胞骨架的重组，控制着细胞迁移、浸润和转移；通过对细胞生长周期的调控与细胞的生长、分化相联系，在多种恶性肿瘤中高表达，并且和肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关。Rho蛋白平时以无活性的GDP形式存在于细胞内，在鸟苷酸交换因子(Guanine nucleotide exchange factors，GEFs)的作用下转换为GTP形式的Rho蛋白从而发挥作用[1-2]。鸟苷酸交换因子中最重要的Dbl家族成员一般在结构上均有一个由200个氨基酸组成的DH结构域(Dbl homology domain)和一个紧随其后的约有100个氨基酸组成PH结构域(Pleckstrin homology domain)。

体外实验表明DH可以独立完成Rho家族蛋白由GDP形式向GTP形式的转化(即激活Rho家族蛋白)；PH的主要功能是将GEFs导向Rho家族蛋白丰富的细胞膜区。只有DH-PH一起才能引起细胞的恶性转化[1-2]。因此，DH-PH即为Dbl家族成员基本的功能单位。正常情况下Dbl家族成员处于自我抑制状态。它们一般在出现N末端或C末端截断突变后被激活，进而通过将Rho-GDP转变为Rho-GTP而激活Rho家族以控制细胞的生长发育和浸润转移等。

Dbl家族与肿瘤发生发展有着密切的关系，例如Dbl癌基因发现于弥漫性B细胞淋巴瘤[3]，Ost来源于骨肉瘤[4]，Tiam-1来自T细胞淋巴瘤等[5]。从事相关领域研究的科学家认为Dbl家族成员在许多肿瘤的发生发展中可能起着决定性的作用[6]。该家族在人类基因组计划后被证实约有80个成员[7]，并不断有新成员被陆续发现。本研究针对近年来被发现的GEF家族成员鸟苷酸交换因子10(Rho Guanine nucleotide exchange factor 10，ARHGEF 10)进行序列和功能上的研究，阐述了其对GTPase的调控作用，ARHGEF 10能够促进细胞的恶性表型，属于癌基因。

1 材料与方法

1.1 蛋白质序列及生物信息学分析

ARHGEF 10的全长序列通过NCBI blastp检索得到(GenBank：BAA20754.3)；ARHGEF 10的结构功能域(Domain)分析是通过SMART[8]和PFAM2 3.0(Wellcome Trust Sanger Institute，Canbrige.UK)程序分析得到；ARHGEF 10与GEFs成员进行多序列比对(Multiple alignment)，首先通过ClustalX 2.0软件分析[9]，并用GeneDoc软件[10]对aln结果进行比对，通过计算distance matrix分析得到的进化树是用treeview[11]和MEGA4.1[12]程序联合完成。

1.2 质粒构建

ARHGEF 10的cDNA克隆自人类表达序列标签(EST)。ARHGEF 10-DHPH分别构建至哺乳动物细胞表达载体pDest26-his及pRK5-myc。RhoA，Cdc42，Rac1通过PCR扩增并构建至pCMV-HA载体。pGEX-GST-PAK、pGEX-GST-mDia、pCEFL-GST-RhoAV14表达质粒为Zheng教授馈赠(美国田纳西州辛辛那提大学儿童医学中心)。

1.3 抗体及试剂

Anti-HA抗体(1∶1 000，eBioscience)，anti-myc抗体(1∶1 000，Biolegend)，anti-GST抗体(1∶1 000，Cell Signaling)，rhodamine-phalloidin(罗丹明-鬼笔环肽，Sigma-Aldrich，St louis，Mo)，谷胱甘肽beads(Thermo Scientific，Rockford)，Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen，CA)，IRDye 800CW驴抗兔/鼠IgG荧光二抗(H+L，LI-COR，Lincon)。

1.4 GST-Pull down

Rho家族蛋白活性检测通过GST-Pull down实验完成，以mDia(GST-RBD)和PAK(GST-PBD)融合蛋白作为诱饵对RhoA、cdc42和Rac1进行结合实验。GST融合蛋白转化至大肠杆菌E.coli BL21，当菌体OD值达到0.7～1.0，即以0.1 mM IPTG进行诱导表达。ARHGEF 10-DHPH表达质粒及空白质粒转染293T细胞，培养48 h后收集细胞，用RIPA细胞裂解液提取蛋白。细胞蛋白裂解液与GST beads结合蛋白孵育3 h后，以PBS+1% triton洗三次，PBS洗三次，SDS buffer重悬后，进行Western blot SDS-page胶检测。

1.5 Realtime PCR

Realtime PCR检测ARHGEF 10在人不同组织中的表达情况。引物设计通过primer 6.0完成，通过对人类cDNA(48种包含第一链的人类主要组织；Human Rapid-Scan Plate，OriGene Technologies，Inc.，Rockville，MD)中目的基因ARHGEF 10进行Realtime PCR扩增。正向引物：5-GAGGTTCCCACAGTTCATCC-3，反向引物：5-GCTTGTTCAGGTATCTTTCGT-3；反应体系为16.3 μL，包括600 nmol/L上下游引物，200 nmol/L探针，0.5单位Platinum SuperFiTMTaq聚合酶，200 μmol/L的dATP，dCTP，dGTP，dTTP及1×PCR buffer。PCR反应程序为：95℃15 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，40个循环。所得到数据使用iQ5 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)进行分析。

1.6 免疫荧光检测细胞骨架

以DMEM F12培养基及10%胎牛血清培养NIH3T3细胞，5%CO2，37℃下培养24 h。8 mm玻片用多聚赖氨酸处理后置于24孔板内，接种NIH3T3，转染ARHGEF 10-DHPH表达质粒，48 h后，以多聚甲醛固定，1%triton-PBS破壁处理后，孵育一抗anti-myc，FITC-标记的羊抗鼠IgG抗体以及TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明)标记的鬼笔环肽后，于共聚焦显微镜下检测。

1.7 细胞增殖实验

将转染了ARHGEF 10-DHPH表达质粒的实验组和对照组细胞NIH3T3分别以每孔400个细胞接种于96孔培养板中，按照Cell Counting Kit-8试剂盒要求检测肿瘤细胞的增殖情况，并绘制生长曲线图。

1.8 细胞迁移实验

将转染了ARHGEF 10-DHPH表达质粒实验组和对照组细胞NIH3T3接种于12孔培养板，形成细胞单层，每组平行4个样本。用移液器滴头沿培养板底部作一个宽度为0.8 mm左右的划痕，镜下记录划痕区相对距离，用无血清培养液洗涤，更换1%胎牛血清培养液，培养24 h后更换10%胎牛血清的培养液，继续培养24 h，观察并照相。

1.9 细胞侵袭实验

将BD公司的Transwell小室放入24孔培养板中，在小室外加入混合的条件培养液和完全培养液；在小室内分别加入实验组和对照组NIH3T3细胞，每组重复4个样本。常规培养48 h，取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉签擦去微孔膜上层的细胞，无水乙醇固定，结晶紫染色。在显微镜下随机挑取5个视野计数穿膜的细胞数，取每个视野的平均数表示肿瘤细胞的侵袭能力。

1.10 软琼脂集落形成实验

将低熔点琼脂糖与细胞培养基混合制备底层琼脂，于孔板中温室凝固；取转染组及对照组NIH3T3对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液并计数，调节细胞浓度至2 500个/孔；将低熔点琼脂糖与细胞培养基混合制备上层琼脂，每孔加上层琼脂和单细胞悬液，混匀，室温凝固。于细胞培养箱中培养2～3周，计数含50个细胞以上的克隆，计算细胞集落形成率，DAPI染色，显微镜下计数，进行统计学分析。

1.11 双荧光素酶报告基因检测

将目的基因、下游小分子转录因子(Luciferase)、内参(PRL-TK)按照一定比例共转染293T细胞，37℃培养48 h后，以阳性裂解液(Promega)裂解细胞，轻柔摇动20 min，混匀后使用LI-COR synergy system进行检测。萤火虫荧光素酶检测转录因子活性，海肾荧光素酶检测内参PRL-TK活性，pTA为空白对照。

1.12 统计学分析

用GraphPad Prims 5.0软件及SPSS17.0软件进行作图及统计学处理，计量资料使用均数±标准差的形式表示，各组数据符合正态分布使用单因素方差分析和双因素方差分析，多重比较使用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对ARHGEF 10的生物信息学分析

SMART软件对ARHGEF 10 分子进行生物信息学分析，结果显示，ARHGEF 10基因大小为4215 bp，表达后蛋白分子为156 kD，具有Dbl家族癌基因特有的顺序排列的相对保守的功能区：RhoGEF结构域，属于Dbl家族成员，此外，该分子还具有将蛋白锚定到细胞膜上的PH结构域，是一个结构上典型的Dbl家族成员(图1A，B)；进一步对ARHGEF 10基因及其他典型Dbl家族分子进行序列比对，该部分采用ClustalW软件基于两两比对渐进的多重序列比对方法对其进行同源分析，结果显示ARHGEF 10与Dbl家族其他成员的同源性水平较低，揭示ARHGEF 10在具有DH-PH基本功能域的同时，可能还具有与其他GEFs不同的调控机制(图1C)。

2.2 ARHGEF 10在正常组织中的表达检测

使用SYRB Realtime-PCR检测ARHGEF 10在人48种正常组织中的表达情况。以乳腺组织为对照进行表达差异的比较。ARHGEF 10在小肠、肺、胃、子宫和阴道中的表达较高，其中肺中的表达最高。在食管、肾、肝、外周血白细胞、乳腺、肌肉、鼻黏膜、甲状腺、舌和腭垂中的表达较低，其中在肌肉和卵巢中基本不表达(图2)。

2.3 ARHGEF 10主要通过RhoA发挥其调控作用

GST-Pull down实验显示，ARHGEF 10-DHPH可以在体内与激活的RhoA、Rac1、Cdc42结合，具有GEF活性，但其与RhoA的结合最为明显(图3A)。此外在对转染ARHGEF 10-DHPH的NIH3T3细胞进行免疫荧光双染后发现，表达ARHGEF 10-DHPH的细胞中细胞骨架的应力纤维(Stress fiber)呈现明显的增多趋势，提示ARHGEF 10主要激活小G蛋白家族的RhoA，从而调控细胞骨架中应力纤维的增多(图3B)。从上述两个实验结果可以推断，ARHGEF 10主要通过激活RhoA从而发挥GEF的功能。

图1 生物信息学方法对ARHGEF10的序列分析Figure 1 Sequence analysis of ARHGEF10 by bioinfomatics methodsNote：A.The full-length sequence of ARHGEF 10 protein；B.Domains of ARHGEF 10(SMART software)；C.ARHGEF 10 and Dbl family members multiple sequence alignment and phylogenetic tree.

图2 ARHGEF 10在人48种组织样本中表达情况Figure 2 The mRNA expression of ARHGEF 10 in 48 human tissue samples Note：According to the Ct values to calculate the relative expression.

图3 检测ARHGEF 10对Rho家族成员的激活情况Figure 3 ARHGEF 10 activation members of Rho familyNote：A.ARHGEF 10 activates the Rho family of small G proteins in vivo by Pull-Down assay；B.The effect of ARHGEF 10 on the cytoskeleton of mouse NIH3T3 fibroblasts was detected by immunofluorescence.(a.Cytoskeleton labeled with TRITC-phalloidin；b.Cells transfected and expressed pRK5-myc-ARHGEF-DHPH).

2.4 ARHGEF 10对细胞恶性表型的影响

2.4.1 ARHGEF 10对NIH3T3细胞增殖的影响 使用CCK-8法测定分别转染了ARHGEF 10-DHPH及Dbl-DHPH的NIH3T3细胞生长曲线，结果显示两组细胞在相同时间周期内，生长速率较接近，而与转染空载体细胞相比，生长速度明显增加。通过两因素重复检测方差分析得到，转染ARHGEF 10的实验组与对照组相比，其细胞增殖速率明显增加，与转染阳性对照质粒组趋势一致，实验组与细胞培养时间之间有交互效应，随着细胞培养时间增加，细胞数明显增多，以阳性对照组(Dbl-DHPH)增加最多，具有统计学意义。该实验结果表明上调ARHGEF 10的表达可以明显促进成纤维细胞NIH3T3细胞的增殖速率(图4C)。

2.4.2 ARHGEF 10对细胞迁移、侵袭能力的影响 应用Matrigel基质胶包被的transwell小室观察细胞的体外侵袭能力，我们发现，转染了ARHGEF 10-DHPH的NIH3T3细胞穿膜细胞数明显多于转染空载体的细胞，同时以转染Dbl-DHPH的细胞作为阳性对照(图4A，B)；然而划痕实验结果却显示，转染ARHGEF 10-DHPH细胞的迁移能力与转染空载体的细胞相比，没有明显的变化，细胞迁移率明显低于转染了Dbl-DHPH的阳性对照组细胞(图4D)。以上结果显示ARHGEF 10表达上调会增加细胞侵袭能力，但是对细胞迁移能力没有明显作用。

2.4.3 ARHGEF 10对细胞体外成瘤能力的影响 在体外软琼脂克隆形成试验中，我们以低熔点琼脂糖作为基质模拟体内环境，对转染了ARHGEF 10-DHPH的NIH3T3细胞进行了成瘤能力的研究。结果显示，与空白对照组(转染空载体的细胞)相比，转染了ARHGEF 10-DHPH的细胞具有明显的克隆形成能力，与阳性对照转染Dbl-DHPH细胞的克隆形成能力相当(图5)。该实验说明ARHGEF 10具有明显的细胞体外成瘤能力。

2.5 双荧光素酶报告基因检测ARHGEF 10对转录因子活性的影响

选取293T细胞系，以空载pDest26作为空白(阴性)对照，pDest26-Dbl-DHPH作为阳性对照，通过双荧光素酶报告基因(萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶)检测，对共转ARHGEF 10-DHPH，pRL-TK(海肾荧光素酶，内参)及下游效应分子(7种转录因子，及空白对照pTA)的胞内荧光素酶活性进行检测。结果显示，结合空白及阳性对照组数据进行分析，ARHGEF 10对pIRSE报告基因活性有明显上调作用，提示该分子可能与JAK/STAT信号通路有关(图6)。

图4 ARHGEF 10对细胞恶性表型的影响Figure 4 Effects of ARHGEF 10 on cell malignant phenotypeNote：A and B.The effect of ARHGEF 10 on invasion of NIH3T3 cells；C.The effect of ARHGEF 10 on proliferation of NIH3T3 cells；D.The effect of ARHGEF 10 on migration of NIH3T3 cells.

图5 ARHGEF 10对细胞体外成瘤能力的影响Figure 5 Effects of ARHGEF 10 on tumorigenic ability in vitro

图6 ARHGEF 10对下游小分子转录因子活性的影响Figure 6 The effects of ARHGEF 10 on the activity of downstream small molecule transcription factors

4 讨论

鸟苷酸交换因子(GEFs)家族可以激活下游的Rho家族蛋白从而引起细胞的生长、转化、侵袭和转移[7]，是典型的癌基因家族。从事相关领域研究的科学家认为Dbl家族成员在许多肿瘤的发生发展中可能起着决定性的作用[7]。近些年来，不断有新的Dbl家族分子陆续被发现并报道，2007年，一个与Dbl家族成员VAV3具有高同源性的新GEF分子-EhGEF3被发现，研究指出该分子对RhoA和Rav1具有很强的GEF活性[13]；2016年，一个能够调控Rab家族成员Rab11的GEFs-REL1被发现，该新GEFs能够通过调节Rab11的定位从而影响细胞周期[14-15]。然而，对新的Dbl分子的研究不应仅仅停留在其GEF活性的研究上，对于此类分子的调控机制及具体作用位点的研究，是进一步揭示其作用机理的重要途径，比如，一个新的Dbl家组成员P63RhoGEF活性调控机制，最早研究发现该基因序列中只含有DHPH功能域[16]，发现其与Gαq蛋白功能亚基具有相互结合作用，并能上调其GEF活性，同时发现PH域对其GEF活性存在抑制作用[17]。之后Rojas等人对其活性调控机制研究发现，在其PH结构域后方存在一个保守序列[18]，并由此推测了该序列的空间结构；Lutz等人由此最终得到Gq蛋白、p63RhoGEF及RhoA的复合物的空间结构[19]。

在人类基因组计划完成后，发现了许多重要的Dbl家族癌基因，本研究针对其中一个尚未深入研究的GEFs-ARHGEF 10进行了结构及功能上的分析，对其在Dbl家族中的地位有了进一步的认识；细胞内GEF活性测定结果显示，该基因对Rho家族几个具有代表性的分子(RhoA，cdc42，Rac1)均有一定的激活作用；在用免疫荧光法检测ARHGEF 10对细胞骨架的影响中，我们发现高表达ARHGEF 10-DHPH的NIH3T3细胞具有明显的形成Stress fiber的能力，而Stress fiber的形成与RhoA的激活具有显著的关联性，此发现也进一步证明了ARHGEF 10对RhoA具有激活作用。Rho家族小分子的确定也明确了ARHGEF 10在信号通路中下游的关键作用位点，为进一步展开其活性调控机制研究奠定了基础。

转录因子活性的调控是信号通路研究中的关键，我们选取7个信号通路研究中常见的转录因子，通过ARHGEF 10对其转录因子活性检测后发现，myc，ISRE的转录因子活性受到明显上调。myc基因是一类已知的癌基因，以往的研究中发现c-myc基因位点与Ig基因位点之间的易位会使c-myc易位到高活性转录区，从而组成一个高转录活性的重排基因，启动c-myc转录，使c-myc表达增强，促进细胞恶变，最后导致肿瘤的发生[20]。目前认为胃癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、何杰金氏病及头部肿瘤等都有myc基因的扩增或过度表达。实验结果提示ARHGEF 10可能与myc基因易位有着某种联系，从而通过myc上调改变细胞周期，引起细胞恶性增殖。另外，ARHGEF 10对ISRE及STAT3的上调结果也提示，ARHGEF 10可能与JAK-STAT通路及诱导MHCI类分子的转录调节存在某种关联[21]，从而参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程，但具体的传导通路还有待进一步研究，总之，对转录因子活性的研究对于我们找寻治疗癌症的重要药物靶点提供了可靠的理论依据。

近年有部分关于ARHGEF 10的研究报道，发现ARHGEF 10的N末端(1-322aa)属于功能负调控区，322位氨基酸突变后会引起对RhoA的活性增加以及减慢神经传导速度的变化，并针对神经系统进行了其机制的探讨[22]，另有报道发现，ARHGEF 10中包含一个WD40类似的结构域及2个跨膜片段，具有典型的RhoB活性并能在NIH3T3细胞中诱导肌动蛋白纤维的生成，是一个特定的Rho-GEF家族的成员[23]。该结论与我们的研究结果有部分一致之处，但是并没有针对与肿瘤发生发展过程的研究与意义展开讨论，因此，本研究为ARHGEF 10进一步应用于临床抗肿瘤治疗奠定理论基础，在我们的后续研究中，将确定该基因的肿瘤特异性，并将进一步探索ARHGEF 10在肿瘤细胞中的分子调控机制，对于全面了解肿瘤的发生发展具有重要的意义。

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IdentificationofguaninenucleotideexchangefactorARHGEF10anditsrelationshipwithtumormalignantphenotype

TANGQiulin，BIFeng

Department of Laboratory Molecular Targeted Therapy of Tumor and Medical Oncology，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China

ObjectiveThe guanine exchange factors(GEFs)of Dbl family is a major regulatory unit for the malignant transformation of Rho family proteins.It plays a role by converting Rho protein from inactive GDP form to GTP form of Rho protein.In this paper，we discuss the structure and function of a GEF molecule-ARHGEF 10，and discuss its role in the process of tumor development.MethodsThe expression of ARHGEF 10 in 42 normal tissues was measured by Real-Time PCR.GST-pulldown technique was used to detect the GEF activity of ARHGEF 10 in vivo.The transcription factor activity of downstream small molecules was detected by dual-luciferase report gene assay.The high expressive effect of ARHGEF 10 on normal cytoskeleton morphology was performed by dual immunofluorescence staining labeling method.High expressive effects of ARHGEF 10 on cell proliferation，invasion and tumorigenic ability in vitro were examined using CCK8，Transwell and soft agar clony formation assays.ResultsARHGEF 10 has a typical GEFs structure，which binds to RhoA in vitro and promotes the proliferation and invasion of NIH3T3 cells，and has significant ability to clone in vitro.ConclusionARHGEF 10 is a typical family molecule of guanosine exchange factor that activates RhoA of Rho family，which has obvious oncogene characteristics.

Guanine nucleotide exchange factors；ARHGEF 10；Dbl；Rho GTPases；Oncogene

国家自然科学基金面上项目(81572731)；国家重点研发计划重点专项项目(2016YFC1303203)

四川大学华西医院肿瘤分子靶向治疗研究室及肿瘤中心(成都 610041)

唐秋琳，女，(1981-)，硕士，实验师，从事肿瘤细胞生物学的研究。

唐秋琳，E-mail：tangqiulin1981@163.com

R730.2

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.06.001

(收稿：2017-06-26)