转Bt棉主茎叶Cry1Ab/c蛋白含量的时空分布分析

肖海兵 王鹏军 李先锋 董红强 杨明禄

（1. 塔里木大学植物科学学院，阿拉尔 843300；2. 农业部阿拉尔作物有害生物科学观测站，阿拉尔 843300；3. 新疆生产建设兵团第一师阿拉尔农场，阿拉尔 843300）

转Bt棉主茎叶Cry1Ab/c蛋白含量的时空分布分析

肖海兵1，2王鹏军1李先锋3董红强1，2杨明禄1，2

（1. 塔里木大学植物科学学院，阿拉尔 843300；2. 农业部阿拉尔作物有害生物科学观测站，阿拉尔 843300；3. 新疆生产建设兵团第一师阿拉尔农场，阿拉尔 843300）

为明确M-49和X-37转基因棉Cry1Ab/c蛋白在主茎叶片的时空分布，采用酶联免疫法（ELISA）对主茎叶片的Cry1Ab/c蛋白含量进行检测，并利用考马斯亮蓝法检测叶片水溶性总蛋白含量。结果表明：X-37主茎叶片Cry1Ab/c蛋白整体含量高于M-49；两种转Bt棉主茎叶的Cry1Ab/c蛋白含量由顶端向底层逐渐增加，现蕾期（6月3日）和初花期（6月27日）底层叶片Cry1Ab/c蛋白含量显著高于顶端叶片；花铃期（8月6日）和铃期（8月26日）中上部叶片Cry1Ab/c蛋白含量均无明显差异。另外，在初花期（6月27日）主茎上部叶片的Cry1Ab/c蛋白与水溶性总蛋白比显著高于中下部叶片。总体上，两种转Bt棉主茎叶片Cry1Ab/c蛋白叶片含量分布由下至上逐渐减少，随生育期的推进呈先增后降，在初花期的上部叶片Cry1Ab/c蛋白与水溶总性蛋白比变化较其他生育期明显。

转Bt棉；Cry1Ab/c蛋白；酶联免疫；时空分布；水溶性总蛋白

转基因抗虫棉在我国种植已有20多年历史［1］，转Bt棉可降低棉田虫害程度，减轻农药污染，已成为我国棉花主栽类型［2-3］。然而，随抗虫棉种植时间推移，其对棉铃虫的防治效果有下降趋势，棉铃虫室内生测也发现2代发生期的转Bt棉叶致死率高于3、4代发生期［4］，这种转Bt棉抗虫性波动与棉花生育期Bt毒蛋白表达呈前期强、中后期弱有关［7］，在空间分布上叶片杀虫蛋白含量高于生殖器官［5-6］。另外，外部环境对Bt蛋白表达也有较大影响，极端低温与湿度互作使Bt棉开花后的抗虫性有明显下降［8］，38℃以上，棉蕾的 Bt蛋白表达量均显著下降［9］。施氮肥能明显促进棉叶Bt蛋白的表达，其Bt蛋白表达量与可溶性蛋白、游离氨基酸及全氮含量呈极显著正相关关系［10］。转Bt棉开花后用赤霉酸或缩节胺处理可促进Bt蛋白表达［11］。利用表油菜素内酯、甲哌嗡和水杨酸混合处理能提高转Bt棉在盛蕾期上部叶片、花铃期下部叶片及果枝叶的毒蛋白含量［12］。因而Bt蛋白表达含量波动较大，既与植株内在因素有关，又受外部环境等因素影响。本文以当地较为常见的种植品种为研究对象，通过检测主茎不同叶序棉叶Cry1Ab/c蛋白和总水溶性蛋白含量，分析Cry1Ab/c蛋白含量的时空变化规律，为棉花生产中构建棉铃虫防控体系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 抗虫棉X-37和M-49，采自阿拉尔垦区棉田。随机选择5株生长一致、叶片大小相近棉花，采集主茎由下往上的第2、4、6、8、10、12、14叶片，于-80℃冰箱保存备用。采样时期分别为现蕾期（6月3日）、初花期（6月27日）、花铃期（8月6日）和铃期（8月26日）。

1.1.2 仪器 电子分析天平（AL204，梅特勒-托利多仪器有限公司）、高通量组织研磨器（SCIENTZ-48，宁波新芝生物科技股份有限公司）、酶标仪（Multiskan FC，Thermo）、 紫 外 可 见 分 光 光 度 计（E220，Thermo）、冷冻离心机（X1R，Thermo）、Cry1Ab/c试剂盒（AP003，EnviroLogix公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品液的提取 用打孔器取转Bt棉叶片直径1 cm，并万分之一天平称重后放入2 mL离心管中，加入PH7.4磷酸-吐温（PBS-T）提取液1.2 mL，置于高通量组织研磨器65 HZ研磨匀浆，在4℃，5 000 r/min离心15 min，取上清液为待测样品液。

1.2.2 水溶性总蛋白质含量测定 参考考马斯亮蓝（G-250）染色法［13］：取待测样品液 0.1 mL，稀释 10 倍，分别加入2.5 mL考马斯亮蓝（G-250）、混匀，放置5 min后，于波长595 nm处比色，测定吸光度，并通过标准曲线查的蛋白质含量。

1.2.3 Cry1Ab/c蛋白含量的测定 采用EnviroLogix公司Cry1Ab/c的抗体夹心ELISA定量检测试剂盒（AP003）进行Bt蛋白含量测定。

1.2.4 数据处理 以Excel 2007进行数据处理及作图，利用SPSS17.0进行多重比较（Duncan氏新复极差检测）相关统计分析。

Cry1Ab/c蛋白含量（ng/g）=Cry1Ab/c蛋白含量（ng）/样品叶片鲜重（g）；

Cry1Ab/c蛋白比=Cry1Ab/c蛋白含量（ng/g）/水溶性总蛋白含量（μg/g）

2 结果

2.1 两种转Bt棉Cry1Ab/c蛋白叶片含量的时空分布

M-49转Bt棉主茎叶片的Cry1Ab/c蛋白含量由顶端叶片向底层叶片逐渐增加趋势（图1），其中现蕾期（6月3日）第2、4叶Cry1Ab/c蛋白含量显著（P＜0.05）高于第6、8叶；第2、4叶和6叶极显著（P＜0.01）高于第8叶。在初花期（6月27日）第2叶Cry1Ab/c蛋白明显高于其他叶片，达极显著水平（P＜0.01）；除第12叶外，其他叶片Cry1Ab/c蛋白含量无明显差异。花铃期（8月6日）和铃期（8月26日）中上部叶片第8、10、12和14叶Cry1Ab/c蛋白均无明显差异。

X-37转Bt棉主茎叶的Cry1Ab/c蛋白含量由上至下也呈逐渐增加趋势（图2）。但不同在于现蕾期（6月3日）第2叶Cry1Ab/c蛋白含量显著（P＜0.05）高于第4、6和8叶，其中第6、8叶达极显著水平（P＜0.01）。在初花期（6月27日）第2、4叶的Cry1Ab/c蛋白含量极显著（P＜0.01）高于其他叶片；第6叶Cry1Ab/c蛋白含量也极显著（P＜0.01）高于第8、10、12和14叶。花铃期（8月6日）第14叶Cry1Ab/c蛋白显著（P＜0.05）低于第8、10和12叶。铃期（8月26日）中上部叶片第10、12和14叶Cry1Ab/c蛋白均无明显差异。Cry1Ab/c蛋白含量分布均由下至上逐渐减少，随生育期的推进呈先增后降，现蕾期的Cry1Ab/c蛋白含量较高，初花期、花期、花铃期逐渐降低。整体上，X-37主茎叶Cry1Ab/c蛋白含量较高于M-49。

图1 M-49转Bt棉Cry1Ab/c蛋白叶片含量的时空分布

图2 X-37转Bt棉Cry1Ab/c蛋白叶片含量的时空分布

2.2 两种转Bt棉Cry1Ab/c蛋白的总蛋白比分析

M-49和X-37两种抗虫棉主茎底层叶片第2、4和6叶Cry1Ab/c蛋白与总蛋白比均无显著差异，花铃期（8月6日）和铃期（8月26日）的第10、12叶Cry1Ab/c蛋白比呈稳定减少趋势（表1）。但在初花期（6月27日）第10、12和14叶的Cry1Ab/c蛋白比显著（P＜0.05）高于花铃期和铃期。

3 讨论

因此，这两种转Bt棉主茎不同叶序棉叶转Bt基因棉M-49和X-37在时空分布上存在明显差异，主茎叶片Cry1Ab/c蛋白含量由下至上逐渐减少，这与 Rochester［14］、余恩等［15］报道一致，如浙大13-1转基因抗虫杂交棉的主茎下部叶Bt蛋白含量显著高于上部叶，但不同于转Bt新棉33B和GK3上部棉叶Bt蛋白含量显著高于老叶［16］，以及浙大13-2和其亲本的两部位叶片Bt蛋白含量差异并不明显［15］。这可能与转基因抗虫棉品种有关系。另外，转Bt棉M-49和X-37生育前期的叶片Cry1Ab/c蛋白含量明显高于生育中后期，这与邢朝柱等［16］和王冬梅等［17］研究结果相近。这种时空分布将会导致新疆南疆棉区的棉铃虫能较好的防治2代棉铃虫，但3、4代棉铃虫防治效果会整体呈现下降趋势［18］。因此，为了避免加速棉铃虫对转Bt棉产生抗性，有必要筛选抗虫表现更好的棉花品种，结合常规棉花布局建立庇护所［19］，更有利于棉铃虫的治理。

转基因棉M-49和X-37主茎上部叶片在生育期后期Cry1Ab/c蛋白含量明显下降。这可能与棉株的外部环境和内在因素的影响较大有关，极端温度、氮肥、盐碱等不良外界因素对Bt杀虫蛋白表达存在影响［8，10，14，20］，在前期棉株体内代谢旺盛，Cry1Ab/c蛋白积累较多，而后期棉花由营养生长转为生殖生长，Cry1Ab/c基因表达受到一定影响［17］。研究表明GPT、GOT等活性与Cry1Ab/c蛋白含量存在极显著的正相关［21］。总体上，组织中Bt杀虫蛋白与总可溶性蛋白含量呈正相关［9，21］，但不同时期和部位叶片表现有一定差异，而主茎中上部叶片第8、10、12和14叶在初花期的杀虫蛋白比值变化显著较大。此外，棉花生长后期的Bt蛋白含量下降的内因可能由于棉花生长前期Bt基因过量表达，而使后期基因沉默或启动子甲基化［22］；或因某种降解蛋白酶降解，单宁的结合使其失活［23］。因此，还需进一步明确Bt杀虫蛋白的下降主因，分析初花期后的Cry1Ab/c蛋白比变化内在因素，为更好地指导转Bt基因棉的生产应用提供参考。

表1 两种不同转Bt棉Cry1Ab/c蛋白的总蛋白比分析（ng/μg-1）

4 结论

转基因棉M-49和X-37品种主茎叶片Cry1Ab/c蛋白含量存在时空差异，时间上随棉花生育期的推进呈先增后降，同时期由下部至上部叶片逐渐减少，但叶片中的水溶性总蛋白比值有上升趋势。

［1］ 郭三堆, 王远, 孙国清, 等. 中国转基因棉花研发应用二十年［J］. 中国农业科学, 2015, 48（17）：3372-3387.

［2］ 崔洪志, 郭三堆. 我国抗虫转Bt基因棉花研究取得重大进展［J］. 中国农业科学, 1996, 29（1）：93.

［3］ 汪若海, 李秀兰. 我国转基因抗虫棉应用现状及建议［J］. 生物技术通报, 2000（5）：1-6.

［4］ 吕丽敏, 雒珺瑜, 等. 冀鲁豫棉区Bt棉Cry1A蛋白表达及对棉铃虫控制效果监测［J］. 棉花学报, 2013, 25（5）：459-466.

［5］ 束春娥, 等. 转基因棉Bt毒性表达的时空动态及对棉铃虫生存、繁殖的影响［J］. 棉花学报, 1998, 10（3）：131-135.

［6］丁瑞丰, 等. 新疆南部棉区转Bt基因棉花对棉铃虫抗性的季节性变化规律［J］. 植物保护学报, 2012, 39（3）：193-199.

［7］ Luo Z, Dong HZ, Li WJ, et al. Individual and combined effects of salinity and waterlogging on Cry1Ac expression and insecticidal efficacy of Bt cotton［J］. Crop Protection, 2008, 27：1485-1490.

［8］陈源, 韩勇, 花明明, 等. 低温和湿度胁迫对盛铃期Bt棉叶片Bt蛋白表达量的影响［J］. 棉花学报, 2014, 26（4）：290-294.

［9］陈源, 韩勇, 等. 高温对Bt棉盛蕾期蕾中Bt蛋白表达及氮代谢生理的影响［J］. 应用生态学报, 2014, 25（9）：2623-2628.

［10］杨长琴, 徐立华, 等. 氮肥对抗虫棉Bt蛋白表达的影响及其氮代谢机理的研究［J］. 棉花学报, 2005, 17（4）：227-231.

［11］张祥, 马爱丽, 房静, 等. 赤霉酸和缩节胺对转Bt基因抗虫棉棉铃Bt毒蛋白表达及氮代谢的影响［J］. 棉花学报, 2010,22（2）：150-156.

［12］ 宋国琦. Bt抗虫棉不同叶位Bt基因时空表达差异及调控［D］.杨凌：西北农林科技大学, 2003, 25-38.

［13］ 李合生. 植物生理生化实验原理和技术［M］. 北京：高等教育出版, 2000, 7：184-185.

［14］ Rochester IJ. Effect of genotype, edaphic, environmental conditions, and agronomic practices on Cry1Ac protein expression in transgenic cotton［J］. Journal of Cotton Science, 2006, 10 ：252-262.

［15］ 余恩, 蔡芸菲, 赵茹冰, 等. 2个转基因抗虫杂交棉Bt蛋白含量的时空表达特性研究［J］. 浙江大学学报：农业与生命科学版, 2016, 42（1）：17-22.

［16］邢朝柱, 等. 转Bt基因棉杀虫蛋白含量时空分布及对棉铃虫产生抗性的影响［J］. 棉花学报, 2001, 13（1）：11-15.

［17］王冬梅, 丁瑞丰, 等. 新疆南部棉区转Bt基因棉花Bt杀虫蛋白表达规律研究［J］. 植物保护, 2011, 37（6）：97-101.

［18］王冬梅, 李海强, 等. 新疆北部地区转Bt基因棉外源杀虫蛋白表达时空动态研究［J］. 棉花学报, 2012, 24（1）：18-26.

［19］李号宾, 吴孔明, 等. 新疆南部棉区棉铃虫发生趋势及Bt棉花的控制效率［J］. 中国农业科学, 2006, 39（1）：199-205.

［20］夏兰芹, 郭三堆. 高温对转基因抗虫棉中Bt杀虫基因表达的影响［J］. 中国农业科学, 2004, 37（11）：1733-1737.

［21］Chen DH, Ye GY, Yang CQ, et al. The Effect of high temperature on the insecticidal properties of Bt cotton［J］. Environmental and Experimental Botany, 2005, 53：333-342.

［22］Dong GZ, Li WJ. Variability of endotoxin expression in Bt transgenic cotton［J］. Journal of Agronomy and Crop Science,2007, 193：21-29.

［23］董双林, 文绍贵, 王月恒. 转Bt基因棉对棉铃虫存活、生长及为害的影响［J］. 棉花学报, 1997, 9（4）：176-182.

Tempo-spatial Distribution of Cry1Ab/c Protein in the Main Stem Leaves of Transgenic Bt Cotton

XIAO Hai-bing1，2WANG Peng-jun1LI Xian-feng3DONG Hong-qiang1，2YANG Ming-lu1，2
（1. College of Plant Science，Tarim University，Alar 843300；2. Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Alar，Ministry of Agriculture，Alar 843300 ；3. Alar Farm of the First Planners in Xinjiang Production and Construction Corps，Alar 843300）

The objective of this study is to reveal the tempo-spatial distribution of Cry1Ab/c protein in main stem leaves of transgenic cotton variety M-49 and X-37. The Cry1Ab/c protein content and the water-soluble protein in the main stem leaves from transgenic Bt cotton were detected by enzyme linked immunoassay（ELISA）and Coomassie brilliant blue method，respectively. The results showed that the content of Cry1Ab/c protein in the main stem leaves of the cotton variety X-37 were greatly higher than that in M-49. The contents of Cry1Ab/c protein in both varieties increased gradually from the top leaves to the bottom leaves. The Cry1Ab/c protein content of the bottom leaves were greatly higher than that of the top leaves at squaring period（3 June 2016）and initial flowering stage（27 June 2016）（P ＜ 0.05），but there were no significant differences on the content of Cry1Ab/c protein between the upper and middle parts of the main stems at blossoming and boll forming stage（6 August 2016）and boll period（26 August 26 2016）. Besides，the proportion of the Cry1Ab/c protein content to the watersoluble protein content in the upper leaves were greatly higher than that in the middle and lower leaves in main stem of transgenic Bt cotton（27 June 2016）. In summary，the content of Cry1Ab/c protein in the main stem leaves of both varieties decreased gradually from the bottom leaves to the top leaves，and the trend of the content of Cry1Ab/c protein lowered after increased with its growth period going on，and the ratio of the Cry1Ab/c protein to the water-soluble protein content from the upper leaves changed more significantly at initial flowering stage than other developmental stages.

transgenic Bt cotton；Cry1Ab/c protein；ELISA；temporal and spatial distribution；water-soluble protein

2017-06-05

科技支疆计划项目（2014AB009），塔里木大学校长基金青年项目（TDZKQN201601）

肖海兵，男，硕士，讲师，研究方向：转基因作物风险评估；E-mail：xiaohaibing11@126.com

杨明禄，男，硕士，副教授，研究方向：农业昆虫与害虫防治；E-mail：ymlzkytd@163.com

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0462

（责任编辑 朱琳峰）